α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1937

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase,，α-L-Af）屬于糖基水解酶家族,，可以從含有阿拉伯糖殘基的多聚物如阿拉伯木聚糖,、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等的非還原末端水解生成一個(gè)L-阿拉伯糖分子,。該酶在半纖維素降解以及果實(shí)的成熟軟化過(guò)程中有著重要作用。

α-L-Af分解對(duì)硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷生成對(duì)-硝基苯酚,，對(duì)-硝基苯酚在400nm處有最大吸收峰,，通過(guò)測(cè)定400nm處吸光值變化可計(jì)算得α-L-Af活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè),。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1支加入1.37mL蒸餾水，充分溶解,，用不完的試劑建議分裝后-20℃保存一周,，避免反復(fù)凍融。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：5µmol/mL的對(duì)-硝基苯酚,。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺(tái)式低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、微量玻璃比色皿/96孔板,、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,、EP管。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）:提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取0.1g組織,，加入1mL提取液），冰浴勻漿,。15000g,，4℃離心10min，取上清（若為綠色植物的莖,、葉,、芽等組織，建議將上清用提取液稀釋5倍后檢測(cè),；若為果肉等組織,，上清可直接檢測(cè)或根據(jù)預(yù)測(cè)定結(jié)果稀釋相應(yīng)倍數(shù)后檢測(cè)）置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌,、細(xì)胞：先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi),，離心棄上清后，按照細(xì)胞數(shù)量10⁴個(gè)：提取液體積（mL） 500~1000:1的比例,，建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率200w，超聲3s,，間隔7s,，總時(shí)間3min），然后15000g,，4℃,，離心10min，取上清,，置冰上待測(cè),。

3. 液體：直接測(cè)定。

二,、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 將5µmol/mL的對(duì)-硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)液用提取液稀釋為500,、250、125,、62.5,、31.25、15.625nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,。

3. 操作表 (在1.5mL離心管中) ：

三,、α-L-Af活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸,，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y＝kx+b,，將ΔA帶入方程得到x（nmol/mL）。

2. α-L-Af 活性的計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每mg蛋白每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚為1個(gè)酶活力單位,。

α-L-Af 酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=2x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每g樣本每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚為1個(gè)酶活力單位,。

α-L-Af 酶活（U/g質(zhì)量）= x×V提取÷W÷T= 2x÷W

（3）按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚為1個(gè)酶活力單位,。

α-L-Af 酶活（U/10⁴ cell）= x×V提取÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）÷T= 2x÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（4）按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL樣本每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚為1個(gè)酶活力單位,。

α-L-Af 酶活（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T=2x

V提取：提取液體積,，1mL,；V樣：加入的樣本體積，0.06mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定,；W：樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時(shí)間,，0.5h,。

注意事項(xiàng)：

1. A或ΔA大于1.2時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,。

2. 正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,，若濃度過(guò)高，建議將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進(jìn)行測(cè)定,，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù),；若濃度過(guò)低，建議在樣本提取時(shí)增加組織質(zhì)量,。

3. 加入試劑二后,，建議5min內(nèi)讀取OD值,。