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蛋白發(fā)光染液：蛋白質(zhì)檢測的關(guān)鍵技術(shù)工具
DyLight 系列：DyLight 系列熒光染料涵蓋了從可見光到紅外光區(qū)域的多種產(chǎn)品，如 DyLight 488,、DyLight 549,、DyLight 649、DyLight 680 和 DyLight 800 等,。這些染料的激發(fā)和發(fā)射光譜與常見的激光和濾光片組兼容,，在免疫分析,、蛋白質(zhì)印跡、微陣列,、細胞染色,、流式細胞術(shù)和免疫熒光等多種應(yīng)用中表現(xiàn)出色。例如,，在免疫熒光實驗中,，DyLight 染料標記的抗體能夠清晰地顯示細胞內(nèi)目標蛋白的定位和分布，為研究蛋白質(zhì)的功能和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑提供了有力工具,。苯Pro - Q Diamond 熒光染料：該染料專門用于磷酸化蛋白質(zhì)的染色,。其具有方便、快速,、高靈敏度的特點,，線性范圍超過 3 個數(shù)量級，并且與質(zhì)譜鑒定兼容,。在 2003 年由 Molecular Probes 的 Wavne Patton 報道,，其激發(fā)光波長為 488 nm，吸收峰波長為 532 nm,。研究人員通過將一些蛋白質(zhì)和肽點樣在蛋白質(zhì)芯片上,，使用 Pro - Q Diamond 檢測芯片上蛋白質(zhì)和肽的磷酸化水平，靈敏度可達 312 - 625 fg,，為信號通路和磷酸酶抑制研究提供了良好的平臺 ,。
ProteOrange® 染料：用于聚丙烯酰胺凝膠電泳后蛋白質(zhì)的快速可視化。它是一種含有兩性離子片段的芪型熒光團,，在核酸,、多糖和其他分子存在的情況下，蛋白質(zhì) / 十二烷基硫酸鈉膠束（SDS）會選擇性地結(jié)合該染料,。分子量在 6 kDa 及以上的蛋白質(zhì)可被有效染色,，熒光信號與蛋白質(zhì)濃度在三個數(shù)量級的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。ProteOrange 凝膠染色的靈敏度約為考馬斯亮藍染色的十倍,，雖然低于銀染色,，但與銀染色相比，其染色方案要簡單得多,，不需要洗滌,，對于標準 SDS - PAGE 也不需要固定步驟。整個染色過程 30 - 60 分鐘即可完成,，包括將凝膠在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育,，然后用 7.5% 乙酸短暫沖洗 30 秒。使用波長為 312 - 365 nm 的透射儀即可進行可視化,。
Lumitein™蛋白質(zhì)凝膠染色劑：設(shè)計用于檢測 SDS 聚丙烯酰胺（SDS - PAGE）凝膠中的蛋白質(zhì),，經(jīng)過額外的 SDS 孵育步驟后,，也可用于檢測天然 PAGE 凝膠中的蛋白質(zhì)。該染色劑具有靈敏度,，可檢測到小于 1 ng 的蛋白質(zhì),，與銀染色靈敏度相當。操作簡單快速,，固定和染色可在 30 - 90 分鐘內(nèi)一步完成，隨后只需用清水簡單沖洗,。背景極低,，與常見儀器兼容，可使用 300 nm 紫外凝膠盒（EB 濾光片）,、Dark Reader 或激光掃描儀進行成像。線性檢測范圍寬,，至少可達三個數(shù)量級,，并且與下游分析（如質(zhì)譜和測序）兼容，在室溫下穩(wěn)定性高 ,。
樣品制備與電泳：首先，將待檢測的蛋白質(zhì)樣品進行處理,，如細胞裂解、組織勻漿等,，以提取蛋白質(zhì)。然后通過十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小對其進行分離,。
轉(zhuǎn)膜：將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜（如 PVDF 膜或硝酸纖維素膜）上,，使蛋白質(zhì)固定在膜上,，便于后續(xù)與抗體結(jié)合,。
封閉：用含有封閉劑（如 5% 脫脂奶粉或 BSA）的緩沖液孵育膜,，封閉膜上非特異性結(jié)合位點,，減少背景信號,。
一抗孵育：將膜與特異性識別目標蛋白的一抗孵育，一抗與目標蛋白特異性結(jié)合,。孵育條件通常為 4℃過夜或室溫孵育 1 - 2 小時,，具體時間根據(jù)抗體說明書確定,。
二抗孵育：用洗滌緩沖液（如 PBST）充分洗滌膜后，加入與一抗來源物種匹配的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗,。二抗與一抗結(jié)合,，從而將 HRP 標記到目標蛋白所在位置。二抗孵育一般在室溫下進行 1 - 2 小時,。
洗膜：再次用洗滌緩沖液充分洗滌膜,，去除未結(jié)合的二抗，以降低背景信號,。
發(fā)光液混合與孵育：新鮮配制 ECL 工作液,，將 A 液和 B 液按照 1:1 的比例混合均勻。將混合后的發(fā)光液均勻覆蓋在膜表面,，確保膜浸潤在發(fā)光液中,，室溫孵育 1 - 5 分鐘，使發(fā)光反應(yīng)充分進行,。
信號檢測：孵育完成后，用鑷子小心取出膜,，去除多余的發(fā)光液（可將膜輕靠在吸水紙上吸干多余液體,，但避免膜干燥）,。若使用 X 射線膠片檢測,，將膜放入雜交袋中,，排出空氣后密封,，在暗室中將膠片覆蓋在膜上曝光適當時間（根據(jù)信號強度調(diào)整曝光時間,，從幾秒到數(shù)小時不等），然后進行膠片顯影和定影處理,；若使用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測，將膜放入成像儀樣品室中,，設(shè)置合適的曝光時間和增益參數(shù)，進行圖像采集和分析 ,。
染料選擇與準備：根據(jù)實驗?zāi)康暮偷鞍踪|(zhì)特性選擇合適的熒光染料,，并按照說明書要求將染料溶解在適當?shù)娜軇┲?，配制成所需濃度的工作液?/span>
蛋白質(zhì)標記：將待標記的蛋白質(zhì)與熒光染料工作液按照一定比例混合，在適當條件下孵育,，使染料與蛋白質(zhì)充分結(jié)合,。反應(yīng)條件（如溫度、時間,、pH 值等）需根據(jù)染料類型和蛋白質(zhì)性質(zhì)進行優(yōu)化,。例如，對于一些與氨基反應(yīng)的熒光染料,，通常在中性或弱堿性條件下進行標記反應(yīng),，孵育時間一般為 1 - 2 小時,。
標記后處理：標記反應(yīng)完成后，通過透析,、超濾或凝膠過濾等方法去除未結(jié)合的游離染料,，以獲得純凈的標記蛋白質(zhì)樣品。
檢測與分析：將標記好的蛋白質(zhì)樣品用于后續(xù)實驗,，如免疫熒光染色,、流式細胞術(shù)分析等。在檢測過程中,，使用相應(yīng)的熒光激發(fā)光源和檢測設(shè)備，根據(jù)熒光信號的強度,、分布等參數(shù)對蛋白質(zhì)進行定性和定量分析,。例如，在免疫熒光染色實驗中,，將標記蛋白質(zhì)的樣品與細胞或組織切片孵育,，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，確定蛋白質(zhì)在細胞或組織中的定位和表達水平 ,。
蛋白質(zhì)表達與功能研究：在探究基因功能時，需要了解基因表達產(chǎn)物 —— 蛋白質(zhì)的表達水平和功能,。通過使用蛋白發(fā)光染液,，科研人員可以準確檢測蛋白質(zhì)在不同細胞系、組織或發(fā)育階段的表達變化,。例如,，在研究腫瘤發(fā)生機制時，利用 ECL 超敏發(fā)光液結(jié)合 Western Blot 技術(shù),，檢測腫瘤相關(guān)蛋白在正常細胞和腫瘤細胞中的表達差異,，有助于發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤標志物和治療靶點。在蛋白質(zhì)功能研究方面,，通過熒光染料標記蛋白質(zhì),，可以實時追蹤蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的定位、運動和相互作用,，深入了解蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能和參與的信號通路 ,。
蛋白質(zhì)修飾研究：蛋白質(zhì)的修飾（如磷酸化、乙?；?、甲基化等）對其功能具有重要調(diào)節(jié)作用。Pro - Q Diamond 等專門用于檢測特定修飾蛋白質(zhì)的發(fā)光染液,，為研究蛋白質(zhì)修飾提供了有力手段,。通過檢測修飾蛋白質(zhì)的含量和分布變化,，研究人員可以揭示蛋白質(zhì)修飾在細胞生理過程、疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制 ,。
重組蛋白生產(chǎn)與質(zhì)量控制：在重組蛋白藥物的生產(chǎn)過程中,，需要對重組蛋白的表達、純化和質(zhì)量進行嚴格監(jiān)控,。蛋白發(fā)光染液可用于檢測重組蛋白的表達水平,、純度以及是否存在降解產(chǎn)物。例如,，在發(fā)酵液中提取重組蛋白后,，使用 Lumitein™蛋白質(zhì)凝膠染色劑檢測蛋白質(zhì)含量和純度，確保產(chǎn)品質(zhì)量符合標準,。同時,，通過熒光染料標記重組蛋白，可以研究其在體內(nèi)的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特性,，為藥物研發(fā)提供重要數(shù)據(jù) ,。
生物制品檢測：對于疫苗、抗體等生物制品,，需要檢測其中蛋白質(zhì)的含量,、活性和穩(wěn)定性。蛋白發(fā)光染液能夠快速,、準確地檢測生物制品中的蛋白質(zhì)成分,，保障產(chǎn)品的安全性和有效性。例如,，在流感疫苗生產(chǎn)過程中,，利用 ECL 發(fā)光染液檢測疫苗中流感病毒蛋白的含量，確保疫苗劑量準確 ,。
疾病標志物檢測：在臨床診斷中,，檢測血液、尿液等體液中的疾病標志物是早期診斷和病情監(jiān)測的重要手段,。許多疾病標志物為蛋白質(zhì),，通過蛋白發(fā)光染液結(jié)合免疫檢測技術(shù)，可以高靈敏度地檢測這些微量蛋白質(zhì),。例如,，使用 ECL 超敏發(fā)光液檢測血液中的癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）等腫瘤標志物,，有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后判斷,；檢測血清中的心肌肌鈣蛋白等蛋白質(zhì)標志物，可用于急性心肌梗死的快速診斷 ,。
自身免疫性疾病診斷：自身免疫性疾病患者體內(nèi)會產(chǎn)生針對自身蛋白質(zhì)的抗體,。通過檢測這些自身抗體,，結(jié)合蛋白發(fā)光染液進行免疫印跡分析，可以輔助診斷自身免疫性疾病,。例如,，檢測抗核抗體、抗雙鏈 DNA 抗體等自身抗體時,，使用熒光染料標記的二抗,，通過觀察熒光信號來判斷抗體的存在和滴度，為系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的診斷提供依據(jù) ,。
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