化學(xué)發(fā)光染液工作原理：以常用于免疫印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）染液為例,，其核心反應(yīng)體系圍繞辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和魯米諾構(gòu)建,。在檢測(cè)過(guò)程中，首先 HRP 標(biāo)記的抗體與膜上的目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合,，形成抗原 - 抗體 - HRP 復(fù)合物,。隨后加入含有魯米諾和過(guò)氧化氫的 ECL 工作液，在 HRP 的催化作用下,，過(guò)氧化氫分解產(chǎn)生氧自由基,。氧自由基具有強(qiáng)氧化性，會(huì)將魯米諾氧化為激發(fā)態(tài)的 3 - 氨基鄰二甲酸,。處于激發(fā)態(tài)的 3 - 氨基鄰二甲酸不穩(wěn)定,，當(dāng)它回到基態(tài)時(shí)，會(huì)以光的形式釋放多余能量,，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。該信號(hào)的強(qiáng)度與目標(biāo)蛋白的含量相關(guān),，通過(guò)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度和位置,，即可確定目標(biāo)蛋白的存在和含量。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度,，一些 ECL 發(fā)光染液中還添加了特殊的增強(qiáng)劑,，這些增強(qiáng)劑能夠與反應(yīng)中間產(chǎn)物結(jié)合，穩(wěn)定激發(fā)態(tài)分子,，減少能量損失,，顯著增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)并延長(zhǎng)發(fā)光時(shí)間，使檢測(cè)靈敏度可達(dá)到飛克（fg,，10?1?g）級(jí)別,，能夠檢測(cè)到極低含量的目標(biāo)蛋白 。

熒光發(fā)光染液工作原理：熒光蛋白發(fā)光染液利用了熒光染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后在特定波長(zhǎng)光激發(fā)下發(fā)出熒光的特性,。以 DyLight 系列熒光染料為例,，這類染料具有良好的水溶性,、pH 不敏感性、高亮度,、光穩(wěn)定性以及較長(zhǎng)的圖像采集時(shí)間等優(yōu)點(diǎn),。其與蛋白質(zhì)的結(jié)合主要通過(guò)與蛋白質(zhì)的氨基或巰基等活性基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的標(biāo)記,。當(dāng)被標(biāo)記的蛋白質(zhì)受到合適的激發(fā)光照射時(shí),，熒光染料分子吸收光子能量，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),。由于激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定,，電子會(huì)迅速?gòu)募ぐl(fā)態(tài)回到基態(tài)，在此過(guò)程中以光的形式釋放能量,，發(fā)出特定波長(zhǎng)的熒光,。科研人員通過(guò)熒光成像設(shè)備檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和分布,，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析,。不同的熒光染料具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜，這使得科研人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的熒光染料,，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白質(zhì)的同時(shí)檢測(cè),。例如在多重免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，使用不同激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光染料標(biāo)記不同的抗體,，一次實(shí)驗(yàn)即可檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)蛋白,，通過(guò)不同顏色的熒光信號(hào)直觀展示各蛋白質(zhì)在細(xì)胞或組織中的定位和表達(dá)情況 。