超微量分光光度計是一種用于測量微量樣品吸光度的儀器，通常用于核酸和蛋白質(zhì)的濃度測量,。

主要特點：

1.能夠測量微量樣品的吸光度,，通常在納升至微升級別。

2.高靈敏度和精確度,，能夠準(zhǔn)確測量核酸和蛋白質(zhì)的濃度,。

3.通常采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測量。

4.一般具有緊湊的設(shè)計和易操作的特點,。

工作原理：

核酸和蛋白質(zhì)在紫外-可見光波長范圍內(nèi)具有特定的吸光特性,。

通過將樣品放置在光路中，利用光源照射樣品,，測量樣品在特定波長下透射或反射的光強(qiáng),，即吸光度。根據(jù)樣品在特定波長下的吸光度值,，結(jié)合已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)ｉT的軟件,，可以計算出核酸或蛋白質(zhì)的濃度。

超微量分光度計是一種常用的測定DNA和RNA濃度的方法,。

通過測量特定波長下的光密度（OD值）,，可以間接計算出核酸的濃度。

以下是該方法的基本原理和操作步驟：

OD值的含義

OD是optical density的縮寫,，表示被檢測物質(zhì)吸收的光密度,。由于核酸中的堿基具有共雙鍵結(jié)構(gòu)，因此它們具有紫外光吸收特性,。

不同波長的吸收峰

OD260：DNA雙鏈的吸收峰,，主要反映DNA的濃度。
OD280：芳香族氨基酸的吸收峰,，主要用于判斷蛋白質(zhì)污染程度,。
OD230：核酸提取過程中使用的鹽離子在230nm處有吸收峰，如果OD230很高,，說明鹽離子濃度較高,。

純度判斷

OD260/OD280的比值用于判斷RNA或DNA的純度,。高純度的DNA比值應(yīng)該在1.8-2.0之間。

如果比值低于1.8,，說明蛋白質(zhì)污染較嚴(yán)重,；高于2.0，則說明可能有RNA污染,。

操作步驟

準(zhǔn)備核酸樣品：將待測的DNA或RNA樣品溶解在適當(dāng)濃度的緩沖液中,。
測量OD值：使用產(chǎn)微量分光光度計，分別測量260nm,、280nm和230nm處的光密度,。
計算濃度：根據(jù)已知的摩爾消光系數(shù)，計算DNA或RNA的濃度,。

注意事項 
實驗過程中要避免蛋白質(zhì)和鹽離子的污染,，否則會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
測量時要保持樣品池和空白池的清潔,，避免雜質(zhì)干擾。

常見的用途

無論在物理學(xué),、化學(xué),、生物學(xué)、醫(yī)學(xué),、材料學(xué),、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域 ,還是在化工、醫(yī)藥,、環(huán)境檢測,、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門 ,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應(yīng)用。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器,，常用于核酸,，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

超微量分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器,。

常用于核酸,，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

核酸的定量

核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA。

核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù),。

如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig,。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。

測試前,，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測試空白液和樣品液,。然而，實驗并非一帆風(fēng)順,。

讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。

除了核酸濃度,，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值,，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm。

純凈的樣品,，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者~~物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物，多肽等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。

A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,，A320一般是0,。

蛋白質(zhì)直接定量

是在280nm波長，直接測試蛋白,。選擇Warburg 公式,，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。

蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì),。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm 的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”,。與測試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間,。

實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時,，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象,。事實上,，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變,，濃度就會被放大,，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。

蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快，操作簡單,；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾；另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高,。

OD 600

實驗室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細(xì)菌的生長密度,。在遇到要求較高的實驗,，需要采用分光光度計準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。

OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法,。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作,，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),，做出校正曲線,。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時間后,，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng),。

另外,，需注意的是，測試的樣品不能離心,，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài),。