Tubulin Acetylation Enhances Microtubule Stability in Trabecular Meshwork Cells Under Mechanical Stress

Keywords: trabecular meshwork, glaucoma, tubulin acetylation, mechanical stress

小梁網(wǎng)（TM）/Schlemm 管（SC）常規(guī)流出通道中的機(jī)械力被認(rèn)為在調(diào)節(jié)房水（AH）穩(wěn)態(tài)和眼壓（IOP）中起關(guān)鍵作用,。由于脈動或活動（如眨眼和掃視）引起的壓力差和眼壓波動,，流出通道內(nèi)的細(xì)胞會經(jīng)歷拉力或機(jī)械拉伸,。此外,，流出通道細(xì)胞在流經(jīng) TM 和 SC 組織時會受到 AH 流動產(chǎn)生的剪切應(yīng)力。

機(jī)械拉伸會觸發(fā)細(xì)胞骨架中的動態(tài)響應(yīng),，根據(jù)應(yīng)力的大小和持續(xù)時間,，細(xì)胞骨架可能會流化以適應(yīng)力或加強(qiáng)以抵抗力。這種機(jī)械反應(yīng)涉及細(xì)胞骨架成分（包括微管）之間的復(fù)雜協(xié)調(diào),，微管在感應(yīng)機(jī)械力和穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面起著關(guān)鍵作用,。大量研究表明，TM 和 SC 細(xì)胞都可以感知機(jī)械力并通過觸發(fā)旨在調(diào)節(jié)各種流出阻力的細(xì)胞過程（包括細(xì)胞骨架重塑）來做出反應(yīng),。但目前還沒有研究探討機(jī)械拉伸與 TM 和 SC 細(xì)胞中微管（MT）細(xì)胞骨架之間的關(guān)系,。

微管蛋白乙酰化,，特別是在 α-微管蛋白第40位的賴氨酸（K40）殘基上,，是一種與 MT 的穩(wěn)定性和機(jī)械特性相關(guān)的關(guān)鍵翻譯后修飾。微管蛋白乙?；鰪?qiáng)了微管的柔韌性和彈性,，對機(jī)械應(yīng)力起到保護(hù)作用并防止結(jié)構(gòu)損傷。

最近,，在美國杜克大學(xué)眼科中心及俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)凱西眼科研究所的一項研究中,，探討了對照組和青光眼組 TM 細(xì)胞微管蛋白乙酰化響應(yīng)循環(huán)機(jī)械拉伸（CMS）的動態(tài)調(diào)控和功能意義,，以及微管蛋白乙?；瘜π∈篌w內(nèi) IOP 的作用。這是第一項探索微管蛋白乙?；诹鞒鐾ǖ绖恿W(xué)調(diào)節(jié)中的功能研究,。研究成果發(fā)表于 Investigative Ophthalmology & Visual Science 期刊題為“Tubulin Acetylation Enhances Microtubule Stability in Trabecular Meshwork Cells Under Mechanical Stress”。

首先,，使用蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光分析研究了在有和沒有 CMS （8% 伸長率）的人眼小梁網(wǎng)細(xì)胞（HTM）原代培養(yǎng)物中賴氨酸40 （Ac-TUBA4）處 ?-微管蛋白乙酰化的發(fā)生情況,。結(jié)果顯示,，TM 細(xì)胞中 Ac-TUBA4 的組成型基礎(chǔ)水平（圖1 A）。與未拉伸對照相比，拉伸處理培養(yǎng)物中 Ac-TUBA4 水平顯著升高,。免疫熒光證實,，CMS 作用下 Ac-TUBA4 增加（圖1 B、C）,。還觀察到細(xì)胞定位的變化,。Ac-TUBA4 主要位于未拉伸細(xì)胞的核周區(qū)域，并且在拉伸細(xì)胞中顯示出更廣泛的細(xì)胞質(zhì)染色,。這表明,，循環(huán)機(jī)械拉伸在 TM 細(xì)胞中誘導(dǎo)微管蛋白乙酰化,。

MT管腔內(nèi)通過α-微管蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（α-ATAT1）對α-微管蛋白進(jìn)行K40乙?；S后通過HDAC6和SIRT2進(jìn)行脫乙?；?。特異性敲低 ATAT1、HDAC6 和 SIRT2,，通過蛋白質(zhì)印跡評估 Ac-TUBA4,、SIRT2 和 HDAC6 的水平。與對照細(xì)胞相比,，敲低 ATAT1 導(dǎo)致 Ac-TUBA4 水平顯著降低,，相反，敲低 HDAC6 導(dǎo)致 Ac-TUBA4 水平增加,，而敲低 SIRT2 沒有顯著影響,。這些結(jié)果表明,，ATAT1 和 HDAC6 分別調(diào)節(jié) TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙?；兔撘阴；?。

隨后檢查了這些酶的表達(dá)在 CMS 條件下是否發(fā)生改變,。與未拉伸培養(yǎng)物相比，CMS 顯著降低了 HDAC6 蛋白水平,。SIRT2 水平略有下降,，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義。未觀察到 CMS 下 ATAT1 mRNA 水平發(fā)生變化,。這些發(fā)現(xiàn)表明,，CMS 通過下調(diào) HDAC6 來增加 Ac-TUBA4，從而降低微管蛋白脫乙?；乃俾?。

圖1     CMS 下 TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙酰化,。

接下來,，使用從受青光眼（GTM）和年齡匹配對照組（NTM）影響的供體眼睛中分離的 TM 細(xì)胞的原代培養(yǎng)物重復(fù)上述實驗。值得注意的是,，在非拉伸條件下,，與 NTM 培養(yǎng)物相比，GTM 培養(yǎng)物表現(xiàn)出更高水平的 Ac-TUBA4 （圖2 A）,。然而,，在 GTM 細(xì)胞和 NTM 細(xì)胞之間未觀察到 HDAC6 或任何 SIRT2 亞型表達(dá)的顯著差異（圖2 A）。CMS 的應(yīng)用進(jìn)一步增加了 GTM 細(xì)胞中 Ac-TUBA4（圖2 B）,。這表明,，青光眼型 TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙酰化水平升高,。

越來越多的證據(jù)表明,，與同齡對照眼相比，青光眼的 TM 更僵硬,。因此,，研究了 GTM 細(xì)胞中較高的 Ac-TUBA4 水平是否是由于剛度增加造成的，檢測在不同基質(zhì)剛度上（5-kPa 和 60-kPa,；900-kPa,；～1 GPa）培養(yǎng)的 NTM 和 GTM 細(xì)胞裂解物中的 Ac-TUBA4 水平。無論基質(zhì)剛度如何,，與 NTM 細(xì)胞相比,，GTM 細(xì)胞始終表現(xiàn)出更高的 Ac-TUBA4 含量。在 NTM 細(xì)胞中未觀察到基質(zhì)剛度對 Ac-TUBA4 水平的影響,?？傮w而言，實驗結(jié)果不支持底物剛度對微管蛋白乙?；闹苯佑绊?。

圖2    非拉伸和 CMS條件下青光眼 TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙?；?。

對其他細(xì)胞類型的研究表明，微管蛋白乙?；谡{(diào)節(jié)細(xì)胞收縮性中的作用,。鑒于 TM 細(xì)胞收縮性與 AH 流出的相關(guān)性，在 ATAT1（siATAT1）敲低表達(dá)的 TM 細(xì)胞中進(jìn)行了基于膠原蛋白的凝膠細(xì)胞收縮性測定,，TGFβ2（10 ng/mL）處理的細(xì)胞作為陽性對照,。正如預(yù)期的那樣，TGFβ2 處理促進(jìn)了細(xì)胞收縮性，而沉默 ATAT1 表達(dá)導(dǎo)致膠原凝膠松弛,，Ac-TUBA4 水平較低,。此外，ATAT1 敲低還抑制了 TGFβ2 誘導(dǎo)的收縮性,。

進(jìn)一步實驗評估了 tubacin 的作用,，tubacin 是一種有效的 HDAC6 抑制劑，可抑制微管蛋白脫乙?；?，導(dǎo)致乙酰化微管蛋白含量顯著增加,。出乎意料的是,，tubacin 處理導(dǎo)致 TGFβ2 誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮性降低。盡管乙?；⒐艿鞍缀恳叩枚?，但 tubacin處理并未逆轉(zhuǎn)在 siATAT1 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中觀察到的細(xì)胞松弛。

此外,，還探討了 Rho 激酶抑制劑是否可以改變微管蛋白乙?；剑Y(jié)果表明,，在Y27623 處理的 TM 細(xì)胞中未檢測到 Ac-TUBA4 水平的顯著變化（圖3）,。這些發(fā)現(xiàn)支持 ATAT1 在調(diào)節(jié) TM 細(xì)胞收縮性中的作用，而不是微管蛋白乙?；?。

圖3     Rho 激酶抑制劑對微管蛋白乙?；挠绊?。

K40 位點(diǎn)微管蛋白的乙酰化被認(rèn)為可提供穩(wěn)定性并防止微管破裂,。研究人員旨在確定 tubacin 處理誘導(dǎo)的微管蛋白乙?；缴呤欠窨梢苑乐?nocodazole（一種已知的微管解聚劑）誘導(dǎo)的微管解聚。圖像顯示,，tubacin 處理的細(xì)胞中微管彎曲更少、更長,，并且裂縫更少,。此外，與 siCNT 轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,，nocodazole 處理導(dǎo)致 siATAT1 中更快速和顯著的解聚效應(yīng),，在30 分鐘后幾乎沒有觀察到可見的完整乙酰化微管。這些數(shù)據(jù)表明,，微管蛋白乙?；煞乐?TM 細(xì)胞中的微管破裂。

最后,，實驗研究了微管蛋白乙?；瘜?IOP 的影響，將tubacin（10 μM）注射到C57BL / 6J小鼠的前房中,，對側(cè)眼接受DMSO載體對照注射,，記錄晝夜眼壓測量值（圖4 A、B）,。注射 tubacin的眼睛在第 1 天,、第 2 天和 第 3 天觀察到眼壓顯著降低，逐漸恢復(fù)到基線水平,。這表明 tubacin 對 IOP 的降低作用主要?dú)w因于前房內(nèi)注射而不是局部應(yīng)用,，驗證了單獨(dú)局部應(yīng)用 tubacin 沒有顯著的降眼壓作用。通過免疫熒光證實,，注射tubacin的眼睛的TM和睫狀體中的Ac-TUBA4水平較高（圖4 C）,。

圖4    Tubacin 處理可降低小鼠的 IOP,。

總之,，該研究強(qiáng)調(diào)了微管蛋白乙酰化在 TM 細(xì)胞對機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)中的關(guān)鍵作用及其對 IOP 調(diào)節(jié)的潛在影響,。機(jī)械拉伸通過下調(diào) HDAC6 誘導(dǎo) TM 細(xì)胞中的微管蛋白乙?；瑥亩鰪?qiáng) MT 穩(wěn)定性,。青光眼 TM 細(xì)胞中微管蛋白乙?；弑砻鞔嬖诘窒黾拥臋C(jī)械負(fù)荷的代償機(jī)制。雖然微管蛋白乙?；坪醪恢苯诱{(diào)節(jié) TM 細(xì)胞收縮性,，但它對 MT 不穩(wěn)定起保護(hù)作用。體內(nèi) tubacin 對 IOP 的降低作用強(qiáng)調(diào)了在青光眼治療中調(diào)節(jié)微管蛋白乙?；闹委煗摿?。未來的研究應(yīng)探索 ATAT1 對細(xì)胞收縮性影響的分子機(jī)制，并探討靶向微管蛋白乙?；谘凵韺W(xué)和病理學(xué)中的長期影響,。

參考文獻(xiàn)：Su CC, Desikan V, Betsch K, Shim MS, Keller KE, Liton PB. Tubulin Acetylation Enhances Microtubule Stability in Trabecular Meshwork Cells Under Mechanical Stress. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025 Jan 2;66(1):43. doi: 10.1167/iovs.66.1.43. PMID: 39820277; PMCID: PMC11753476.

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