免疫印跡（Western blot, WB）是分子生物學(xué)中檢測復(fù)雜生物提取物中特定蛋白質(zhì)存在的常用方法之一。WB必須控制上樣量以確保目標(biāo)蛋白變化具有可比性,，通常選擇在所有組織中普遍分布的具有相對恒定量的蛋白質(zhì)作為內(nèi)參（Loading control）,。

為何要選用內(nèi)參

在Western Blotting中使用內(nèi)參就是在試驗中另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參蛋白。內(nèi)參就是內(nèi)部參照,，一般是指管家基因編碼表達(dá)的蛋白,，它們在各個組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照,。

如何選擇內(nèi)參抗體

1.樣本種屬來源

 選擇內(nèi)參首先要考慮的就是實驗樣本來源于什么物種,。哺乳動物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin,、β-tubulin,、GAPDH、Lamin B,、Na+/K+-ATPase, Histone H3 等,。植物來源實驗樣本,，則可以選擇Plant actin、Rubisco等,。其他來源樣本研究較少,，所以就應(yīng)該參照文獻(xiàn)報導(dǎo)，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參,。

2.目的蛋白分子量

選擇內(nèi)參抗體時,，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應(yīng)該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上,。比如檢測目的蛋白分子量為45KD,，此時不適宜選擇β-actin（42KD）作為內(nèi)參，可以考慮選擇GAPDH（36KD）作為內(nèi)參,。

3.目的蛋白表達(dá)部位

就一般的蛋白檢測來說,，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了,，而針對于核蛋白的定量,，特別是樣本蛋白就是核蛋白時，選擇恰當(dāng)?shù)暮说鞍變?nèi)參則更能體現(xiàn)內(nèi)部參照的價值,。常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A,、Lamin B、Histone H3,，除此之外,，其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70,、K80等,，在一些文獻(xiàn)報道中，Erk2,、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun,、c-Fos等都有使用。而對于膜蛋白檢測,，常用的內(nèi)參抗體為Na,K ATPase,。對于線粒體蛋白的檢測，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體,。內(nèi)參的選擇需要考慮實際的試驗環(huán)境,，比如某些細(xì)胞中，由于組織缺氧,、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高,，不適合做內(nèi)參。比如在在凋亡實驗時,，Lamin等也不適合作為內(nèi)參,。因此設(shè)計實驗方案的時候應(yīng)該考慮這些因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn),，在實驗過程中也應(yīng)該注意如果內(nèi)參表達(dá)出現(xiàn)異常，應(yīng)考慮這方面因素,。

斯達(dá)特內(nèi)參抗體

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