干細胞是怎樣“養(yǎng)出來”的？

一,、清洗與分離：獲取富含MSC的“華通氏膠”組織

1,、材料準備

新鮮臍帶組織（最好在出生后36小時內(nèi)處理）

無菌PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）,、無菌手術(shù)刀,、無菌剪刀/鑷子,、10cm無菌解剖皿、50ml離心管

2,、去除雜質(zhì)

將臍帶置于無菌解剖皿中,，用PBS反復(fù)沖洗，去除殘余血液及運輸液體,。

建議切割成約5cm的小段,，便于后續(xù)操作。

3,、分離血管與華通氏膠

在每一小段臍帶上縱向淺切一刀,，注意不要切穿血管。

用鑷子輕輕扒開臍帶,，露出中央的兩條動脈和一條靜脈,。

用鑷子將血管連同包裹的白色膠狀組織（血管周圍的“華通氏膠”）分離出來,。

小心操作,，盡量避免損傷血管內(nèi)皮層，減少其他細胞污染,。

4,、剝離與切塊

剝離下來的“華通氏膠”組織，用剪刀/手術(shù)刀切成1~3mm見方的小塊,，保持組織濕潤,，避免干燥。

組織塊可暫時放在含PBS的離心管中,，靜置備用,。

二,、切割與鋪板：為細胞“安家”

1、準備培養(yǎng)器皿

選擇適合的培養(yǎng)瓶（如T25,、T75等）,，事先用適宜的細胞貼壁底物處理（常見為膠原或?qū)Ｓ觅N壁液），按說明書比例稀釋并包被,，室溫靜置2小時后備用,。

2、移植組織塊

用寬口移液器或無菌鑷子,，將1~3mm見方的華通氏膠組織塊均勻放置在培養(yǎng)瓶底部,。

建議每瓶間距均勻，不要堆疊,，確保每塊都有接觸瓶底的機會,，有利于貼壁。

3,、添加培養(yǎng)基

緩慢加入預(yù)熱好的間充質(zhì)干細胞專用培養(yǎng)基,，通常8~10ml/瓶（以T75為例），覆蓋組織塊但不宜太多,，以免組織漂浮,。

4、初期培養(yǎng)

放入37℃,、5% CO?培養(yǎng)箱,，靜置5~7天，期間不宜移動,，以便組織塊穩(wěn)定貼壁,。

觀察培養(yǎng)基顏色，不宜wan全變黃或干涸,，必要時可補充部分新鮮培養(yǎng)基,。

三、培養(yǎng)與換液：細胞“爬出”與擴散

1,、首ci換液

培養(yǎng)5~7天后,，大多數(shù)組織塊已牢固貼壁，可進行“半量換液”：傾斜瓶體,，用移液器吸走一半舊培養(yǎng)基,，慢慢補充等量新鮮培養(yǎng)基。

輕操作,，避免擾動組織塊,。

2、后續(xù)觀察

繼續(xù)培養(yǎng),，每3-5天換液一次,。隨著時間推移（通常10-14天）,，會發(fā)現(xiàn)細胞逐漸從組織塊“爬”出，鋪展在瓶底,，數(shù)量逐漸增多,。

3、細胞長滿（融合度70~80%）時處理

細胞生長速度根據(jù)組織塊數(shù)量,、初始樣本質(zhì)量等因素略有不同,。一般10~18天左右，細胞可達到傳代標(biāo)準,。

四,、收獲與擴增：獲得大量MSC

1、去除組織塊

先棄去培養(yǎng)基,，用PBS輕輕沖洗瓶底,，去除未貼壁的組織塊及漂浮細胞。

2,、消化收獲

加入適量細胞消化液（如胰酶/膠原酶混合液）,，37℃孵育6~8分鐘。

輕輕拍打瓶壁,，顯微鏡下觀察,，細胞開始脫落。

3,、終止消化與收集

加入等體積含血清或?qū)Ｓ孟K止液終止反應(yīng),。

用細胞濾網(wǎng)（70μm）過濾，收集單細胞懸液,，棄去殘余組織塊,。

4、離心與再接種

300g離心10分鐘,，棄上清,，PBS重懸。

細胞計數(shù),，按1500~3000個/cm2密度接種到新培養(yǎng)瓶中,，繼續(xù)擴增。

2-3天后細胞可達70-80%融合度,，再進入下次傳代,。