一,、使用前準備

1. 器材與試劑

• 計數(shù)板：常見類型包括改良 Neubauer 計數(shù)板（規(guī)格：1×1×0.1 mm3,，分 9 個大方格）、一次性塑料計數(shù)板（如 CHET4-SD100-002）,。

• 工具：顯微鏡（配備 10× 物鏡）,、微量移液器（10~100 μL）、蓋玻片（專用或 22×22 mm 標準玻片）,、細胞懸液,、臺盼藍染色液（如需區(qū)分死活細胞）。

2. 計數(shù)板預(yù)處理

• 清潔：用無水乙醇或 75% 酒精擦拭計數(shù)板表面,，再用無塵紙擦干,，避免油脂或雜質(zhì)影響液體鋪展。

• 安裝蓋玻片：將蓋玻片平穩(wěn)覆蓋在計數(shù)板的計數(shù)區(qū)上方,，確保無氣泡且邊緣緊密貼合（通過毛細作用固定）,。

二、操作步驟

1. 細胞懸液制備

• 混勻樣本：用吸管或移液器反復(fù)吹打細胞懸液 3~5 次,，確保細胞均勻分散（避免沉淀導(dǎo)致取樣偏差）,。

• 稀釋（如需）：若細胞濃度過高（如 >1×10? cells/mL），需用培養(yǎng)基或 PBS 按比例稀釋（如 1:10）,，使計數(shù)時每個中方格細胞數(shù)控制在 5~50 個（便于統(tǒng)計）,。

2. 加樣

• 用微量移液器吸取 10~20 μL 細胞懸液，沿蓋玻片邊緣緩慢滴加（避免直接滴在計數(shù)區(qū)中央）,。

• 液體通過毛細作用自動鋪展并覆蓋計數(shù)區(qū),，確保無氣泡、無液滴溢出邊緣（若有氣泡需重新清潔計數(shù)板并加樣）,。

3. 靜置沉降

• 加樣后將計數(shù)板水平放置于顯微鏡載物臺上,，靜置 1~2 分鐘，使細胞沉降到計數(shù)板底部（避免懸浮細胞導(dǎo)致計數(shù)誤差）,。

4. 顯微鏡觀察與計數(shù)

• 低倍鏡定位：先用 10× 物鏡找到計數(shù)板的中央大方格（含 25 個中方格或 16 個中方格,，根據(jù)計數(shù)板類型而定）。

• 高倍鏡計數(shù)：切換至 20× 或 40× 物鏡,，按對角線原則選擇 4 個角的中方格 + 中央中方格（共 5 個中方格）進行計數(shù),。

• 壓線細胞處理：遵循 “計上不計下，計左不計右” 原則,，避免重復(fù)計數(shù),。

• 死活細胞區(qū)分：若加入臺盼藍，活細胞透明,，死細胞染成藍色,，需分別計數(shù)并計算存活率（存活率 = 活細胞數(shù) / 總細胞數(shù) × 100%）。

5. 計算細胞濃度

• 公式推導(dǎo)：

• 若計數(shù) 5 個中方格的細胞總數(shù)為 $N$,，稀釋倍數(shù)為 $D$,，則：$\text{細胞濃度（cells/mL）}=\frac{N}{5}\times 25\times 10^4\times D=N\times 5\times 10^4\times D$
  （原理：5 個中方格體積為 $5\times 0.1{\text{mm}}^3=0.5\mu \text{L}=5\times 10^{?4}\text{mL}$,，需換算為 1 mL 的濃度）。

三,、注意事項

1. 操作規(guī)范性

• 避免細胞損傷：吹打懸液時力度適中,，避免劇烈震蕩導(dǎo)致細胞破裂（尤其對貼壁細胞或脆弱細胞）。

• 加樣量精準：移液器需定期校準,，加樣時保持垂直角度,，避免液體殘留于槍頭或管壁。

• 溫度控制：細胞懸液和計數(shù)板需保持室溫（20~25℃）,，避免溫度差異導(dǎo)致細胞活性變化或液體揮發(fā),。

2. 計數(shù)準確性優(yōu)化

• 重復(fù)計數(shù)：同一懸液制備 2~3 個計數(shù)板樣本，取平均值（若單次結(jié)果偏差 >10%,，需重新實驗）,。

• 適宜濃度范圍：理想計數(shù)濃度為 1×10?~1×10? cells/mL，濃度過低時建議離心富集（如 500×g 離心 5 分鐘,，棄上清后重懸）,。

3. 污染與損耗控制

• 一次性計數(shù)板：開封后立即使用，避免長時間暴露于空氣中導(dǎo)致灰塵污染,。

• 玻璃計數(shù)板：使用后及時用清水沖洗（勿用硬物刮擦）,，晾干后存放于干燥盒中，避免霉菌滋生,。

• 生物安全：處理感染性樣本（如病毒轉(zhuǎn)染細胞）時,，需在生物安全柜中操作，計數(shù)板用后需高壓滅菌再丟棄,。

4. 結(jié)果記錄與分析

• 記錄計數(shù)日期,、樣本信息、稀釋倍數(shù),、各中方格細胞數(shù)及死活細胞比例,，便于溯源和誤差分析。

• 若結(jié)果異常（如與歷史數(shù)據(jù)偏差 >20%）,，需排查懸液混勻度,、加樣氣泡、計數(shù)板清潔度等因素,，必要時更換新計數(shù)板,。

四、常見問題與解決方案

五,、適用場景與替代方案

• 常規(guī)細胞計數(shù)：適用于懸浮細胞（如 PBMC,、酵母）和消化后的貼壁細胞（如 HEK293、HeLa）,。

• 高精度需求場景：若需自動化計數(shù)或減少人為誤差,，可選用熒光細胞計數(shù)板（配合熒光顯微鏡）或自動細胞計數(shù)儀（如 TC20、Countess III）,。