在PCR實(shí)驗(yàn)中，污染是一個(gè)常見(jiàn)且嚴(yán)重的問(wèn)題,，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。為有效預(yù)防和處理PCR污染,，需遵循以下注意事項(xiàng)：

一,、實(shí)驗(yàn)分區(qū)與操作流程

合理劃分實(shí)驗(yàn)區(qū)域：將實(shí)驗(yàn)分為標(biāo)本處理區(qū)、PCR反應(yīng)液制備區(qū),、PCR擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)，各區(qū)域應(yīng)有明確的隔離和方向性,，避免交叉污染,。

單向工作流程：從預(yù)PCR到后PCR，實(shí)行“單向”工作流程,，確保在后PCR區(qū)域引入的耗材和防護(hù)裝備不會(huì)未經(jīng)消毒就回到預(yù)PCR區(qū)域,。

試劑與樣品分離：PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存,，不應(yīng)放于同一冰盒或冰箱,。

二、試劑與材料準(zhǔn)備

試劑分裝：所有PCR試劑應(yīng)在超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝,，使用專(zhuān)用加樣器和吸頭,，避免交叉污染。

試劑儲(chǔ)存：實(shí)驗(yàn)室自配的試劑（如去離子水,、緩沖液等）在使用前應(yīng)高壓滅菌或過(guò)濾除菌,。

試劑小量分裝：PCR試劑應(yīng)小量分裝，以減少重復(fù)取樣次數(shù),，并置于-20℃保存,。

三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

正確佩戴防護(hù)裝備：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)戴一次性手套,，若不小心濺上反應(yīng)液,，立即更換手套,。

避免氣溶膠污染：操作時(shí)應(yīng)勤換手套，進(jìn)出不同區(qū)域或進(jìn)行模板操作后應(yīng)及時(shí)更換手套,；開(kāi)管動(dòng)作要輕,，以防管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠。

減少操作污染：在同時(shí)進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng)時(shí),，應(yīng)制備主反應(yīng)混合液,，再分裝至PCR反應(yīng)管，最后添加樣品核酸模板,，以減少單個(gè)添加操作繁瑣造成的污染,。

使用防濺污染的吸頭：使用防濺污染的移液器吸頭，減少樣本或試劑中的氣溶膠形成

四,、污染監(jiān)測(cè)與處理

設(shè)立對(duì)照實(shí)驗(yàn)：設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照,，監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況，選擇合適的對(duì)照樣品,。

污染識(shí)別：使用“無(wú)模板對(duì)照”（NTC）,，其中NTC孔包含所有qPCR反應(yīng)組件，但不包含DNA模板,。如果在NTC孔中觀察到擴(kuò)增,，可能表明反應(yīng)組件中存在污染。

污染處理：若發(fā)生污染,，應(yīng)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照監(jiān)測(cè)污染情況,，排除試劑污染后，考慮環(huán)境污染的可能性,，通過(guò)追蹤實(shí)驗(yàn)查找污染源,，必要時(shí)更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所或重新設(shè)計(jì)引物。

五,、實(shí)驗(yàn)室清潔與消毒

定期清潔：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)操作臺(tái)面,、儀器、實(shí)驗(yàn)用具及環(huán)境進(jìn)行清潔,，避免污染,。

消毒措施：使用10-15%的漂白溶液（次氯酸鈉）擦拭表面，讓漂白劑作用于表面10至15分鐘后,，用去離子水擦拭,，最后用70%酒精浸濕的紙巾快速干燥表面。

設(shè)備消毒：定期消毒用于準(zhǔn)備qPCR反應(yīng)的表面和設(shè)備,，包括工作臺(tái)面,、移液器、冰箱/冷凍室把手,、離心機(jī),、渦旋器和其他觸點(diǎn),。

六、污染控制技術(shù)

UNG法：使用尿嘧啶糖苷酶（UNG）去除PCR產(chǎn)物中的污染,，優(yōu)點(diǎn)是能去除任何來(lái)源的污染,，且UNG處理可與PCR擴(kuò)增在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行

DNase I法：采用DNase I法處理反應(yīng)液污染，適用于去除污染DNA,。

固相捕獲法：利用生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交,，再用包被鏈霉親和素的固相載體捕獲雜交核酸，從而去除污染

七,、其他注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)記錄與驗(yàn)證：堅(jiān)持常規(guī)清潔工作,，設(shè)計(jì)陰性對(duì)照組，連續(xù)三天陰性對(duì)照沒(méi)有起跳,，則污染得到控制,。

人員培訓(xùn)：所有操作人員應(yīng)接受?chē)?yán)格培訓(xùn)，確保操作規(guī)范,，減少人為污染風(fēng)險(xiǎn),。

通過(guò)以上措施，可以有效預(yù)防和處理PCR污染,，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,。