實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增系統(tǒng)(qPCR)作為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性技術(shù)，自1996年由美國Applied Biosystems公司推出以來,，已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析,、病原體檢測(cè)、遺傳變異研究等多個(gè)領(lǐng)域,。該技術(shù)通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的變化,，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA或RNA序列的精確量化，為科研人員提供了前-所未有的精準(zhǔn)度與效率,。

　　技術(shù)原理

　　qPCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù),。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,。熒光基團(tuán)可以是SYBR Green等非特異性染料,，也可以是TaqMan探針等特異性標(biāo)記。隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行,，熒光信號(hào)會(huì)隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增強(qiáng),，從而允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并定量初始模板的數(shù)量。

　　熒光擴(kuò)增曲線一般由基線期,、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期組成,。在基線期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,，無法判斷產(chǎn)物量的變化;在指數(shù)擴(kuò)增期,，熒光信號(hào)超過背景信號(hào)并到達(dá)閾值，此時(shí)循環(huán)數(shù)稱為Ct值(Cycle Threshold)，Ct值與模板起始濃度的對(duì)數(shù)值成反比線性關(guān)系,，因此可用于定量模板起始濃度;在平臺(tái)期,，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,，無法用于定量分析,。

　　主要類型與定量方法

　　qPCR所使用的熒光化學(xué)材料可分為兩大類：熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR Green I為主要代表,，是非特異性熒光化學(xué)材料，能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合并發(fā)出熒光,，信號(hào)強(qiáng)度與PCR擴(kuò)增的DNA量成正比,。熒光探針包括TaqMan、分子信標(biāo)等,，屬于特異性熒光材料,。TaqMan探針技術(shù)通過設(shè)計(jì)特異性探針，在PCR擴(kuò)增過程中被切割釋放熒光信號(hào),，實(shí)現(xiàn)高特異性和準(zhǔn)確性的定量分析,。

　　定量方法包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量是通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品來計(jì)算未知樣品的起始拷貝數(shù);相對(duì)定量則是通過比較不同樣本中同一目的基因的相對(duì)表達(dá)量來分析基因表達(dá)差異,。

　　應(yīng)用領(lǐng)域

　　qPCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué),、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域,。在分子生物學(xué)研究中，qPCR技術(shù)可用于基因表達(dá)調(diào)控,、基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究;在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,，qPCR技術(shù)可用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、傳染病監(jiān)控及個(gè)性化醫(yī)療;在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,，qPCR技術(shù)可用于轉(zhuǎn)基因作物的定性檢測(cè),、品系鑒定及轉(zhuǎn)基因成分含量的檢測(cè)。

　　結(jié)論

　　實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增系統(tǒng)(qPCR)以其高靈敏度,、特異性和準(zhǔn)確性,，在核酸定量分析中發(fā)揮著重要作用。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,，qPCR系統(tǒng)的功能和性能也在不斷提升,，為科研人員提供了更加高效、精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)工具,。未來,，qPCR技術(shù)有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，推動(dòng)科學(xué)研究的深入發(fā)展。