關(guān)鍵詞：Ⅰ型5α-還原酶,，Ⅱ型5α-還原酶，肝5α-還原酶,，睪丸5α-還原酶，睪酮,，二氫睪酮,，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，非那雄胺,，化妝品控油功效,，5α-Reductase，5αR1,，5αR2,，SRD5A1，SRD5A2,，Testosterone,，Dihydrotestosterone(DHT),，F(xiàn)inasteride

隨著化妝品行業(yè)的功效細分，功效宣稱的規(guī)范,，消費者對自己皮膚的狀態(tài)越來越關(guān)注,，針對不同膚質(zhì)也會選擇不同功效的護膚品。當前,，皮膚油膩逐漸成為困擾年輕人的主要問題,，消費者對于具有控油功效的化妝品的需求呈現(xiàn)日益增長的趨勢。皮膚油膩與皮脂腺細胞過度分泌油脂有關(guān),，其中,，5α-還原酶（5α-Reductase）是皮膚油脂分泌的一個關(guān)鍵限速酶，其活性與皮脂腺的油脂分泌情況有著緊密的聯(lián)系,?；瘖y品功效成分如果能夠抑制5α-還原酶活性，則能有效地調(diào)節(jié)皮脂腺細胞的活性,，減少油脂的分泌,，從而起到控油的作用。因此,，5α-還原酶活性抑制試驗是評價化妝品控油功效的關(guān)鍵指標,。

01    5α-還原酶簡介

5α-還原酶（5α-Reductase，5αR）是定位于靶細胞微粒體上的膜蛋白,，是雄激素睪酮( Testosterone,T)代謝的關(guān)鍵酶,，共包含Ⅰ型（SRD5A1）、Ⅱ型（SRD5A2）和Ⅲ型（SRD5A3）三種同工酶,。其中,，Ⅰ型5α-還原酶（5αR1）主要分布于肝臟、皮脂腺,、汗腺等器官,，發(fā)揮生理作用的最適pH為6~9；Ⅱ型5α-還原酶（5αR2）主要分布于前列腺,、睪丸,、附睪、精囊,、頭皮毛囊等,，作用最適pH為5.5；而Ⅲ型5α-還原酶（5αR3）研究較少,，其在難治愈的前列腺癌中過度表達,。

5αR可在還原型輔酶Ⅱ(NADPH) 提供電子的條件下將睪酮上4、5位不飽和雙鍵還原,，并轉(zhuǎn)化為更具活性的二氫睪酮（Dihydrotestosterone,，DHT）,。二氫睪酮作為一種比睪酮更強效的雄激素，可加速人皮脂腺細胞的增殖并促使皮脂分泌亢進,，易導致皮膚油膩等問題（圖1）出現(xiàn),，給人們帶來巨大的心理壓力, 影響工作與生活。因此,，通過抑制5α-還原酶的活性以減少皮脂分泌來評價化妝品控油功效,，并將其運用于控油、痤瘡等醫(yī)藥健康產(chǎn)品領(lǐng)域,，其具有重要的研究價值和廣闊的市場前景,。

圖1 5α-還原酶在皮膚油脂分泌中的作用（來源：基于人5α還原酶活性試驗對化妝品控油原料的篩選）

02    5α-還原酶活性抑制試驗與化妝品控油功效評價

根據(jù)化妝品功效宣稱評價項目要求（表1），控油功效宣稱評價方法有三種：人體功效評價試驗,、消費者使用測試和實驗室試驗方法,，配以文獻數(shù)據(jù)支持。其中人體功效和消費者測試這兩種方法為人體方法,，所需的成本高,，周期長。目前市場上認可最多的就是體外實驗室試驗法,，實驗室試驗認可的方法有：皮脂腺細胞試驗和5α-還原酶活性抑制試驗,。

皮脂腺細胞試驗由于細胞的特性，不宜用低毒性或者高于低毒性的化妝品進行檢測,，易使細胞失去活性,。因此：5α-還原酶活性抑制試驗是化妝品控油功效評價最常使用的方案。

表1 化妝品功效宣稱評價項目要求

03    IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

5α-還原酶活性抑制的體外評估方法通常有紫外法,、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法,、放射性同位素法,、熒光法等。其中LC-MS法,、同位素法和ELISA法靈敏度高,，均可準確測定5αR活性，但價格昂貴,，對試驗人員操作技能要求較高,；紫外法雖操作簡單，但測定的目標物NADPH對5αR并無專一性,，易受到其他酶的干擾而造成檢測偏差,。

鑒于此，IPHASE技術(shù)人員建立了一種基于可見分光光度法的5α-還原酶活性抑制效果體外評估的方法,，該方法基于酶循環(huán)原理,，提高了檢測靈敏度和特異性。該方法涉及兩步反應,，首先5α-還原酶將睪酮代謝為5α-二氫睪酮,，接著二氫睪酮在酶的作用下繼續(xù)反應，此反應過程中生成的產(chǎn)物在405nm波長處有特異性的峰值,，通過檢測該產(chǎn)物在405nm波長處的吸光度變化,，用來體現(xiàn)二氫睪酮生成的多少，最終反映5α-還原酶的活性變化,，從而評估化合物的抑制效果（圖2）,。由于檢測產(chǎn)物在405nm處有特異性的吸收峰，因此不受其他物質(zhì)的吸光度的干擾,，提高了檢測特異性,。

圖2 基于可見分光光度法的5α-還原酶活性檢測原理

此外，為更好地滿足不同客戶的需求,，IPHASE技術(shù)人員在此方法基礎上根據(jù)5α-還原酶的類型開發(fā)出Ⅰ型(SRD5A1)5α-還原酶抑制率評估試劑盒和Ⅱ型(SRD5A2)5α-還原酶抑制率評估試劑盒,，可分別用于Ⅰ型5α-還原酶和Ⅱ型5α-還原酶抑制劑的篩選。

兩種試劑盒的不同主要體現(xiàn)在酶的來源和陽性藥物的選擇上,，其中,，Ⅰ型試劑盒為SD大鼠肝5α-還原酶和度他雄胺（Dutasteride），Ⅱ型試劑盒為SD大鼠睪丸5α-還原酶和非那雄胺（Finasteride）,。此外,，試劑盒還包括了睪酮T、NADPH溶液、酶制劑及反應緩沖液等成分,，以確保用戶能夠輕松建立反應體系并進行檢測,。試劑盒中各組成成分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，試驗結(jié)果準確,、可靠,、重現(xiàn)性好。

IPHASE技術(shù)人員對陽性抑制劑非那雄胺的抑制效果進行評估,，根據(jù)試劑盒說明書進行操作,，試驗體系中非那雄胺終濃度為62.5ug/ml，睪酮終濃度為5uM,，SD大鼠睪丸5α-還原酶終濃度為0.2mg/ml,，第一步反應孵育時間為30min，第二步反應的孵育時間為4min,。第二步反應后,，用酶標儀檢測各組別在405nm處的的吸光度值：

按照下列公式進行抑制率的計算：

代入數(shù)值，可得出非那雄胺的抑制率為：

注：陽性對照樣本的抑制率在70%以上,，試驗成立,。

因此，在試驗初期,，本試劑盒提供的方法可作為化合物高通量初篩的一種手段,，簡便、高效,，試驗結(jié)果準確,、可靠。

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