微生物酯酶的常規(guī)分離純化方法：

1. 超濾

超濾是利用壓力或離心力,，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊,，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化,，根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同而選擇不同分子量的膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的,，從而使蛋白質(zhì)得到分離,。

2.鹽析法

鹽析一般是指溶液中加入無機鹽類，蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨著鹽溶液濃度升高而增加,，當鹽濃度不斷上升時,，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此稱鹽析,，從而達到分離純化的效果,。一般粗抽提物常用該法進行粗分。

3.有機溶劑沉淀法

利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法即為有機溶劑沉淀法,。有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù),，削弱溶劑分子與蛋白分子間的作用力，從而增加蛋白質(zhì)分子上帶電粒子的相互吸引力,，致使蛋白分子聚合沉淀,；另有機溶劑溶解于水的同時，能從蛋白質(zhì)周圍的水化層中奪走水分子,，破壞水化層,，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出。

4.凝膠層析

混合物隨流動相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時,，溶液中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離,，在洗脫過程中，分子質(zhì)量大的物質(zhì)因不能進入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外,，分子量最小的物質(zhì)能進入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯,，流速緩慢,，致使最后流出柱外。凝膠層析是一種快速而簡便的分離分析技術(shù),，操作條件比較溫和,，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑,，并且對分離成分理化性質(zhì)的保持有獨到之處,，對于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。因此被生物化學(xué),、分子生物學(xué),、生物工程以及醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。陳寧等利用Sephadex G-25凝膠層析柱和反相柱對核桃蛋白酶解物,，獲得抗氧化能力強的多肽序列Ala-Gly-Gly-Ala,。張志強等，采用硫酸鈉鹽析法與凝膠層析法對卵黃進一步純化,，得到純度為97%的IgY,。

5.親和層析

蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)被吸附而滯留在層析柱中,，沒有親和力的蛋白質(zhì)不被吸附,，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開,，然后選用適當?shù)南疵撘?，改變結(jié)合條件將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來，從而達到分離提純的目的,，這種分離純化蛋白質(zhì)的方法稱為親和層析,。

微生物酯酶的分離純化是一個復(fù)雜的過程，通常包括以下幾個步驟：

1. 富集培養(yǎng)：首先需要從含有酯酶的微生物群體中富集目標微生物,。這可以通過選擇性培養(yǎng)基或特定的生長條件來實現(xiàn),，比如調(diào)整pH值,、溫度或添加特定的底物如咖啡堿,，以促進目標酶的產(chǎn)生。

2. 破壁提?。?/span>一旦獲得了富含目標微生物的培養(yǎng)物,，就需要通過物理或化學(xué)方法（如超聲波破碎、酶解等）破壞微生物細胞壁,，釋放出胞內(nèi)的酶蛋白,。

3. 初步純化：使用鹽析、透析或超濾等方法去除大部分的細胞碎片和小分子雜質(zhì),，得到酶蛋白的粗提液,。

4. 精細純化：根據(jù)酶蛋白的特性,，選擇合適的層析技術(shù)進行進一步純化。常用的層析方法包括離子交換層析,、凝膠過濾層析,、親和層析等。例如,，利用HPLC（高效液相色譜）可以依據(jù)酶蛋白的分子量,、等電點或與其他化合物的特異性結(jié)合能力進行分離。

5. 活性檢測：在每一步純化過程中,，都需要通過酶活性測定來監(jiān)控純化效果,，確保得到的酶具有預(yù)期的催化活性。

6. 純度驗證：最終純化的酶可以通過SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）等方法進行純度驗證,，確保只有一個主要條帶,，表明酶已經(jīng)得到純化。 

7. 酶活力測定：通過特定的酶活力測定方法,，如底物消耗速率或產(chǎn)物生成速率,，來確定酶的活性單位（U）。 

8. 酶的特性研究：對純化的酶進行進一步的研究,，包括最適pH值,、最適溫度、穩(wěn)定性,、底物特異性等,。

整個過程需要根據(jù)具體的酶和來源微生物的特性來調(diào)整，以達到最佳的分離純化效果,。