羅氏LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀系統(tǒng)詳解

一,、引言

隨著分子生物學技術的發(fā)展,，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative PCR，qPCR）已成為基因表達分析,、病原檢測,、突變篩查等領域的重要工具。羅氏公司開發(fā)的LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀憑借其四通道檢測能力,、靈活的實驗設置以及友好的軟件界面,，在科研和臨床實驗室中得到廣泛應用。本文將從儀器構(gòu)造、工作原理,、技術特點,、應用場景、操作流程及維護要點等方面,，系統(tǒng)介紹該設備的性能與使用方法,。

二、設備概述

LightCycler® 96 是一款中通量的實時熒光定量PCR儀,，可容納96孔標準板,，適合日常分子生物學實驗的需求。該系統(tǒng)集成了溫控模塊,、光學檢測系統(tǒng),、控制系統(tǒng)與數(shù)據(jù)分析平臺，能夠?qū)崿F(xiàn)快速,、準確的qPCR擴增與實時數(shù)據(jù)采集,。

主要構(gòu)成包括：

• 溫控模塊：采用帕爾貼元件（Peltier-based system）進行升降溫控制，溫度梯度小,，確保各孔間的溫度均一性,。

• 光學檢測系統(tǒng)：搭載四個熒光通道（常用為FAM、HEX,、ROX,、Cy5），配有獨立的激發(fā)與檢測光路,，支持多重檢測,。

• 操作界面：通過USB或局域網(wǎng)連接PC，配套LightCycler® 96軟件進行程序設置與數(shù)據(jù)分析,。

三,、技術參數(shù)

四,、工作原理

LightCycler® 96 的工作流程遵循標準的實時熒光PCR過程,，其核心為：

1. 模板擴增：在熱循環(huán)條件下，由特異性引物,、探針,、酶等反應組分合成目標DNA。

2. 熒光監(jiān)測：熒光染料與擴增產(chǎn)物結(jié)合,，熒光強度隨著擴增進行而增強,，系統(tǒng)實時記錄每個循環(huán)的熒光值。

3. Ct值計算：軟件自動識別熒光信號達到閾值時的循環(huán)數(shù),，生成Ct（Cycle threshold）值,。

4. 定量分析：通過標準曲線法或ΔΔCt法對未知樣品進行相對或絕對定量,。

五、關鍵特性與優(yōu)勢

1. 精準的溫度控制

LightCycler® 96 的溫控模塊采用多點溫度傳感器和閉環(huán)控制算法,，保障各孔間溫差控制在±0.2°C以內(nèi),。熱循環(huán)效率高，縮短實驗總耗時,。

2. 多通道熒光檢測系統(tǒng)

四個熒光通道可同步采集不同染料信號,，適合SYBR Green法和TaqMan探針法的單重或多重PCR實驗。每個通道設有獨立激發(fā)與發(fā)射濾光片,，避免通道間信號干擾,，提高檢測靈敏度和特異性。

3. 軟件智能化分析

LightCycler® 96配套軟件界面簡潔直觀,，提供圖形化編程與數(shù)據(jù)分析功能,，包括：

• 實時擴增曲線、熔解曲線圖

• Ct值自動計算

• 標準曲線生成與效率評估

• 多重擴增數(shù)據(jù)整合

此外,，軟件支持批量數(shù)據(jù)導出,，便于后續(xù)統(tǒng)計分析與報告撰寫,。

4. 開放性實驗設置

支持用戶自定義擴增程序與檢測方案,，適用于多種應用需求?？蛇M行末端熔解曲線分析,，用于鑒定引物特異性與判斷非特異擴增產(chǎn)物。

六,、典型應用場景

1. 基因表達定量

通過反轉(zhuǎn)錄實時PCR（RT-qPCR）技術,，研究目標基因在不同處理組、時間點或組織中的表達差異,。

2. 病原體檢測

快速檢測病毒,、細菌、真菌等病原體DNA/RNA,，包括新發(fā)傳染病的快速篩查（如新冠病毒,、甲型流感等）。

3. 基因多態(tài)性與突變分析

結(jié)合TaqMan探針或熔解曲線分析技術,，識別單核苷酸多態(tài)性（SNP）與點突變,。

4. 拷貝數(shù)變異分析

適用于腫瘤基因擴增、拷貝數(shù)異常分析,，輔助診斷與藥物靶點篩選,。

七、操作流程簡述

1. 反應體系配制：按實驗方案準備引物,、探針,、酶等反應組分，分裝于96孔板中。

2. 程序設置：在軟件中設定熱循環(huán)參數(shù),，包括初始變性,、退火、延伸步驟及熒光采集通道,。

3. 加載樣品：將PCR板封膜后置于儀器托盤內(nèi),。

4. 啟動實驗：點擊運行按鈕后，系統(tǒng)自動執(zhí)行熱循環(huán)并采集實時熒光信號,。

5. 數(shù)據(jù)分析：實驗結(jié)束后,，使用軟件生成擴增曲線、計算Ct值,、進行定量分析或熔解曲線判斷,。

八、儀器維護與注意事項

為確保設備長期穩(wěn)定運行,，應定期進行以下操作：

• 清潔光學模塊：用無塵布擦拭樣品托盤,，避免熒光通道污染。

• 校準溫控系統(tǒng)：使用標準板驗證溫控均一性,，必要時進行系統(tǒng)校準,。

• 軟件升級與備份：定期檢查軟件更新，導出重要實驗數(shù)據(jù)防止丟失,。

• 防止冷凝水進入儀器：實驗過程中避免樣品板冷凝水倒流,。

九、發(fā)展趨勢與展望

隨著分子診斷技術的發(fā)展,，實時PCR儀器正朝向多通道,、高通量、小型化與自動化方向演進,。LightCycler® 96 在提供可靠數(shù)據(jù)基礎上,，若結(jié)合自動加樣系統(tǒng)、生物信息分析平臺等,，將更好地滿足精準醫(yī)學,、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等多場景應用,。

十、結(jié)語

羅氏LightCycler® 96 實時熒光定量PCR儀以其穩(wěn)定的性能,、友好的軟件操作體驗以及多種兼容的實驗方案,，為分子生物學實驗提供了可靠的技術平臺。盡管在通量和自動化程度上尚有拓展空間,，但作為科研與教學實驗室的常規(guī)工具,，其表現(xiàn)足以支撐日常分析任務,。未來，結(jié)合上游核酸提取與下游數(shù)據(jù)解讀系統(tǒng)的整合,，qPCR平臺的智能化水平有望進一步提升,。