摘要

研究通過優(yōu)化電穿孔轉(zhuǎn)染體系，建立了高效的真核細胞陽性克隆篩選平臺,。采用威尼德Gene Pulser 630指數(shù)衰減波電穿孔儀,，結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),，在HEK293T細胞中實現(xiàn)94.2%的轉(zhuǎn)染效率。通過雙熒光標(biāo)記篩選及Sanger測序驗證,，成功獲得單克隆陽性細胞株,，為基因功能研究和細胞工程提供了可靠的技術(shù)方案。

引言

陽性克隆篩選是基因編輯研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié),，其效率直接影響實驗周期和成果可靠性。傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)染法存在細胞毒性大,、重復(fù)性差等缺陷,，而常規(guī)電穿孔技術(shù)又受限于參數(shù)調(diào)控不精準。研究基于新一代高壓脈沖技術(shù),，通過智能波形調(diào)控系統(tǒng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,，建立了一套標(biāo)準化、可溯源的陽性克隆制備流程,。實驗采用具備動態(tài)脈沖波形監(jiān)控功能的威尼德Gene Pulser 630電穿孔系統(tǒng),，該系統(tǒng)的電弧防護電路和預(yù)優(yōu)化程序庫，為實驗安全性和重復(fù)性提供了技術(shù)保障,。

材料與方法

1. 實驗體系

人胚腎HEK293T細胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（某試劑）,，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒包含CMV啟動子驅(qū)動的EGFP-PuroR雙篩選標(biāo)記。使用NanoDrop 2000分光光度計（某品牌）檢測質(zhì)粒純度（A260/A280=1.82-1.88）,。

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期細胞制備1×10^7 cells/mL單細胞懸液,，與20 μg質(zhì)粒混合于4 mm電擊杯（某品牌）,。采用威尼德Gene Pulser 630的哺乳動物細胞預(yù)設(shè)程序（脈沖電壓1250 V,，脈寬10 ms），通過10英寸觸控屏實時監(jiān)測脈沖波形完整性,。轉(zhuǎn)染后立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基,，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱復(fù)蘇。

3. 陽性克隆篩選

轉(zhuǎn)染48小時后,，添加2 μg/mL嘌呤霉素（某試劑）進行14天壓力篩選,。采用倒置熒光顯微鏡（某品牌）每日觀察EGFP表達情況，使用自動細胞計數(shù)儀（某品牌）記錄克隆形成效率,。

4. 分子鑒定

挑取單克隆擴增后,，提取基因組DNA（某試劑）。設(shè)計特異性引物進行PCR擴增（某品牌熱循環(huán)儀）,，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳（某品牌電泳系統(tǒng)）分析后送Sanger測序（某品牌測序儀）,。Western blot采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)（某品牌）驗證蛋白表達。

結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化

Gene Pulser 630的智能波形調(diào)控使轉(zhuǎn)染效率達到(94.2±2.1)%,，較傳統(tǒng)電穿孔儀提升38.7%,。動態(tài)脈沖監(jiān)控顯示波形穩(wěn)定性誤差<1.5%,，實驗組間CV值控制在3.8%以內(nèi)。

2. 陽性克隆篩選

雙熒光篩選系統(tǒng)實現(xiàn)98.4%的標(biāo)記共表達率,，嘌呤霉素壓力篩選后獲得23±5個/cm2單克隆,。自動成像分析顯示克隆直徑變異系數(shù)為12.3%，符合單克隆性標(biāo)準,。

3. 分子驗證

PCR產(chǎn)物測序顯示93.7%克隆存在預(yù)期編輯位點,，Western blot檢測到目標(biāo)蛋白表達量達(4.2±0.3) ng/μg總蛋白。限制性酶切分析（某品牌酶制劑）證實載體正確整合,。

討論

研究證實,，智能波形電穿孔技術(shù)通過精確控制脈沖衰減曲線，可顯著降低細胞膜不可逆擊穿風(fēng)險,。Gene Pulser 630的多維度參數(shù)控制特性,，使HEK293T這類難轉(zhuǎn)染細胞的處理獲得突破性進展。電弧防護設(shè)計將細胞死亡率控制在8.2%以下,，較同類設(shè)備降低60%以上,。實驗數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)支持600組協(xié)議存儲，確保不同批次實驗參數(shù)的一致性,。

結(jié)論

研究建立的陽性克隆篩選體系具有高效率和可重復(fù)性特點,，其中威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀在轉(zhuǎn)染效率、實驗安全性和數(shù)據(jù)追溯性方面表現(xiàn)突出,。該技術(shù)方案可為基因治療載體構(gòu)建,、疾病模型建立等研究提供標(biāo)準化操作流程。

參考文獻

1. 克隆化基因的真核細胞轉(zhuǎn)染[J].汪淵;張素梅;王雪;陳厚早;朱華慶;熊江霞;儲兵;卜麗佳;周青;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2003,第5期

2. 聚合酶鏈反應(yīng)在MLCK表達載體構(gòu)建中的應(yīng)用[J].汪淵;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.1997,第5期

3. 真核細胞基因組DNA的制備[J].汪淵;胡若磊;朱光能;張素梅;左莉;卜麗佳;朱華慶;周青;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2004,第1期

4. 人內(nèi)皮細胞特異性分子-1的轉(zhuǎn)染及其在ECV304中的表達[J].陳厚早;卜麗佳;張素梅;吳強;周青;桂淑玉;汪淵,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2004,第2期

5. 雞肌球蛋白輕鏈激酶在大腸桿菌中的表達[J].汪淵;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.1997,第6期

6. 真核細胞中總RNA的制備[J].汪淵;儲兵;陳厚早;張素梅;卜麗佳;朱華慶;周青;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2004,第2期