TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒

凋亡細(xì)胞的原位末斷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL法）
    細(xì)胞凋亡的多步驟機制作用的zui終環(huán)節(jié)是,；細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致核染色質(zhì)DNA雙鏈的斷裂,。大量DNA 片段暴露出的3 羥基在末斷轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）或DNA多聚酶的作用下，與生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合,，zui終借助與卵白素或抗地高辛抗體結(jié)合的熒光素或HRP,，使凋亡細(xì)胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來。
    TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒由美國羅氏公司提供
    試劑1： 酶濃縮溶液（Enzyme Solution）
    試劑2： 標(biāo)記溶液（Lable Solution）
    試劑3： 轉(zhuǎn)化劑-POD（Converter-POD）
    酶標(biāo)記抗熒光素抗體（即用型）

    試驗所需其它試劑：
    非石蠟切片:
    ·沖洗緩沖液:磷酸鹽緩沖液（PBS）
    ·阻斷溶液:0.3%H2O2甲醇溶液
    ·固定溶液:4%多聚甲醛（溶劑pH7.4新鮮配制的PBS溶液）
    ·滲透液:0.1%Triton甔-100（溶于新鮮配制的0.1%枸櫞酸鈉溶液）
    石蠟切片:
    ·二甲苯和乙醇（100%,、95%,、90%、80%,、70%用蒸餾水稀釋）
    ·沖洗緩沖液:磷酸鹽緩沖液（PBS）
    ·蛋白酶K 工作液10~20mg/ml溶于10mM Tris/HCl（pH7.4~7.8）
根據(jù)需要選擇:
    ·滲透液:0.1%TritonX-100（溶于新鮮配制的0.1%枸櫞酸鈉溶液）
    ·胃酶溶液（0.25%-0.5%溶于HCl ,，pH2）或胰酶
    ·0.1M枸櫞酸緩沖液，pH6,，微波修復(fù)
    材料： 微波爐,，微波輸出功率850W-2000W2 .選用中性甲醇固定的活檢及實驗動物標(biāo)本，常規(guī)脫水，二甲苯透明,，石蠟包埋,。


                                操 作 步 驟
    抗原微波修復(fù) （供參考）
    1.組織經(jīng)福爾馬林固定后會產(chǎn)生廣泛的蛋白質(zhì)交連，因此石蠟組織進(jìn)行凋亡檢測時要進(jìn)行預(yù)處理,。經(jīng)我公司科研人員的長期研究認(rèn)為：TUNEL染色時蛋白酶K的作用有可能引起內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的釋放,，造成假陽性反應(yīng)，同時過量的蛋白酶K處理可破壞組織的結(jié)構(gòu),，用微波技術(shù)替代上述處理可避免上述弊端的出現(xiàn),。
    2.微波已被愈來愈多地作為免疫組織化學(xué)和原位雜交的預(yù)處理過程， 經(jīng)一定溫度的微波處理可修復(fù)因固定和包埋造成的抗原破壞,，打斷氨基酸的肽鍵結(jié)合，促進(jìn)抗原決 定簇的暴露,，恢復(fù)細(xì)胞膜的空間結(jié)構(gòu),，增加穿透效應(yīng)，加速組織處理及染色過程,。我們在作 TUNEL染色前進(jìn)行微波修復(fù),，可以達(dá)到蛋白酶K的功效，取得較為理想的效果,，背景染色很淺,，凋亡細(xì)胞陽性顆粒與背景染色對比非常鮮明。
    3.蛋白酶K作用的條件嚴(yán)格,，消化度常因組織的不同而在操作中不便掌握,。同時蛋白酶K的價格昂貴，而微波已作為一種常用儀器用于免疫組織化學(xué)染色中,。

    （1 ）切片常規(guī)脫蠟入水
    （2）將一燒杯盛200ml的0.01 M,、pH6.0的檸檬酸緩沖液，加熱至90 ～95℃,，迅速放入切片,，使用680W（80%功率）、微波照射1min,，加入雙蒸水（20～25℃）80ml 作迅速冷卻,，將玻片移至PBS（20～25℃）。     （3）PBS洗5min×3次,。
    （4）加20%正常牛血清室溫30 min,。
    （5）將TUNEL反應(yīng)混合液加在切片上，37℃溫育90min（陰性對照片,、TUNEL混合液中不 加TDT）,。
    （6）PBS洗5min×3次。
    （7）3%H2O2甲醇液室溫阻斷10min。
    （8）37℃溫育90min ,。
    （9）加POD轉(zhuǎn)化劑,，37℃溫育30min。
    （10）PBS洗5min×3次,。
    （11）DAB/H2O2顯色,。
    （12） 蘇木素淡染，常規(guī)脫水,，透明,，中性樹膠封固。
結(jié)果：細(xì)胞核呈棕色顆粒者為陽性細(xì)胞,，結(jié)合形態(tài)特征,，可確立凋亡細(xì)胞。陰性對照片無棕 色顆粒,。

                                細(xì)胞凋亡的檢測技術(shù)簡介（供參考）
                    一. 凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變
    細(xì)胞表面：偽足,微絨毛等消失
    細(xì)胞體形態(tài)：細(xì)胞皺縮,，變形，體積變小
    細(xì)胞核：染色質(zhì)濃縮,，早期染色質(zhì)聚集于核膜邊呈新月形或環(huán)形,，晚期碎裂
    細(xì)胞器：密集但形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴張細(xì)胞膜:完好,，晚期包裹細(xì)胞器或核碎片,，形成凋亡小體
    在組織中表現(xiàn)：常常以單個細(xì)胞散在
    發(fā)生周圍組織反應(yīng)：凋亡細(xì)胞或小體被鄰近巨噬細(xì)胞，上皮細(xì)胞吞噬,，降解,，不發(fā)生炎癥反應(yīng)
    發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細(xì)胞死亡，多發(fā)生于器官萎縮,，細(xì)胞介導(dǎo)的    免疫殺傷機制,，小劑量毒素作用以及多種病理生理狀態(tài)
                    二. 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測方法
    （一）凋亡細(xì)胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測
    1.制片
    （1）常規(guī)組織學(xué)切片，進(jìn)行脫蠟和水化,。
    （2）培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞離心儀制片,。由于凋亡細(xì)胞在制片中容易破碎,所以應(yīng)采用低速離心制片（250g,離心5min），并事先將載玻片用1%BSA處理,，使細(xì)胞易于貼附.離心后涂片,稍經(jīng)空氣中干燥后,，迅速用1%多聚甲醛4℃下固定15-30min，然后轉(zhuǎn)入80%乙醇后固定1-2h,，保存于-20℃待用.
    2.染色方法
    可用多種方法進(jìn)行染色,。
    （1）可采用常規(guī)的組織學(xué)染色方法，如Giemsa染色,，HE 染色或Mayer蘇木素染色.
    （2）采用熒光染料染色,，如DAPI（4′, 6′-diamidino-2-phenylindole）,PI（propidium iodide）和7-AAD（7-aminoacetinomycin D）.其染色濃度為:DAPI 1-2μg/ml;PI 5-10μg/ml;7-AAD 10-20μg/ml.由于PI染料同時也與RNA結(jié)合,所以應(yīng)將細(xì)胞先用RNA酶消化（50Kunitz單位的RNA酶,37℃下作用15min或室溫下30min）后,再進(jìn)行PI染色。
    3. 結(jié)果觀察
    典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞體積縮小及變形；核濃染及喪失亞形態(tài)結(jié)構(gòu),，可見核染色質(zhì)呈新月形,，或核碎裂成大小不等的核碎片；在組織切片上可見巨噬細(xì)胞或鄰近的上皮細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞或凋亡小體,。
    （二）凋亡細(xì)胞的電鏡觀察
    采用電鏡的常規(guī)方法固定,，包埋和制片?？捎猛干潆婄R或掃描電鏡進(jìn)行觀察,。透射電鏡下，凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮,，核膜消失,，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，而細(xì)胞器如線粒體等形態(tài)仍保持良好,，可見被膜結(jié)構(gòu)包繞的細(xì)胞器,，即凋亡小體。掃描電鏡下,，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)如偽足，微絨毛等消失,，細(xì)胞膜呈現(xiàn)波浪狀起伏,。