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浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院胡勁濤等教授在知網(wǎng)發(fā)布的《補充腎活躍血方對去勢骨質(zhì)疏松小鼠骨-血管形成偶聯(lián)調(diào)節(jié)作用的實驗研究》,，探討了補充腎活躍血方對去勢骨質(zhì)疏松小鼠骨量及骨代謝的影響。
實驗中應(yīng)用了布魯克Micro-CT儀器,，三維重建了小鼠的骨組織形態(tài)圖像,。
引言
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是絕經(jīng)女性的常見隱匿健康威脅，特征為骨量減,、結(jié)構(gòu)退變,，骨折風(fēng)險大增。約半數(shù)絕經(jīng)女性患病,，骨質(zhì)疏松性骨折率18%～23%,，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。骨組織血管豐富,，血管與骨形成緊密相關(guān),，絕經(jīng)后骨組織血管減少。腎虛血瘀型多見,，補充腎活躍血方(基于右歸飲加桃仁,、紅花)療效明顯。
本研究用補充腎活躍血方醫(yī)治去勢骨質(zhì)疏松小鼠,，探討其對骨-血管形成及骨代謝的影響,。
實驗前瞻
一、實驗儀器：
實驗儀器JB-P5包埋機,；RM2016病理切片機,；Bruker Skyscan1272三維X射線顯微成像系統(tǒng)；E100光學(xué)顯微鏡,。
Bruker Skyscan1272
二,、實驗準(zhǔn)備：
實驗動物選取50只4～5周齡SPF級健康雌性ICR小鼠,在室溫(24±2)℃、濕度40%～60%,、12 h晝夜交替照明的環(huán)境下飼養(yǎng),。
三、動物分組：
40只ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(10只)和去勢組(30只),。
四、造模：
去勢小鼠造模采用舒泰80 mg/kg腹腔注射麻醉及阿托品0.04 mg/kg肌注減少氣道分泌物,。麻醉完成后剃除小鼠腹部毛發(fā),，予以聚維酮消毒3次后鋪無菌巾。取腹部正中切口，逐層切開腹部肌肉及腹膜,，沿輸卵管尋找到卵巢,，摘除卵巢，縫合傷口,。假手術(shù)模型行只切除卵巢周圍等量脂肪組織,。
五、術(shù)后處理與分組：
去勢組小鼠行卵巢去勢手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)8周,，隨機抽取3只小鼠證實骨質(zhì)疏松造模成功后,，隨機取20 只成模小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組和中藥組，每組各10只,。
六,、給藥:
假手術(shù)組及模型組：等量生理鹽水灌胃。
中藥組：補充腎活躍血方按小鼠給藥劑量換算得小鼠含生藥劑量為8.6 mg/kg,，每日灌胃1次,。
七、樣本收集:
干預(yù)8周后處死,，收集樣本,。
八、實驗開展：
進行Micro-CT,、TRAP染色,、免疫熒光染色( EM-CN、CD31) ,、骨代謝指標(biāo)檢測,。
實驗過程
一、Micro-CT檢測骨組織形態(tài)
小鼠處死后,，我們收集了股骨標(biāo)本，并仔細剔除了骨組織周圍的肌肉及肌腱組織,。接著,，我們使用了Bruker Skyscan1272三維X射線顯微成像系統(tǒng)，按照設(shè)定的參數(shù)(電流140 μA,、電壓70 keV,、掃描厚度12 μm)對股骨遠端進行了掃描。隨后,，我們應(yīng)用了Bruker CTAn Micro-CT Software對骨組織形態(tài)進行了分析,，重點關(guān)注的指標(biāo)包括：骨體積百分比(BV/TV)、小梁數(shù)量(Tb.N)以及小梁厚度(Tb.Th),。
二,、TRAP染色觀察破骨細胞數(shù)量
為了觀察破骨細胞的數(shù)量，我們對骨組織進行了脫鈣包埋處理，并制成了4 μm厚的石蠟切片,。接著,，我們進行了TRAP染色，并在顯微鏡下對破骨細胞的數(shù)量進行了觀察,。為了更精確地分析結(jié)果,，我們采用了Image J軟件進行了圖像分析。
三,、免疫熒光染色觀察股骨遠端干骺端CD31,、EMCN陽性表達
我們首先對石蠟切片進行了脫蠟、抗原修復(fù)和封閉處理,。然后,，我們進行了一抗(CD31、EMCN)的4 ℃孵育過夜,。第二天,，我們進行了相應(yīng)的二抗孵育，并隨后采用了DAPI染液進行染色,。在熒光顯微鏡下,，我們進行了圖片采集，并再次采用了Image J軟件進行了圖像分析,。
四,、骨代謝指標(biāo)檢測
為了檢測骨代謝指標(biāo)，我們收集了小鼠的腹主動脈血液,，并通過200g離心力離心5分鐘來收集血清,。接著，我們應(yīng)用了ELISA法檢測了骨形成指標(biāo)I型前膠原氨基末端肽(PINP)和骨吸收指標(biāo)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP),。
實驗結(jié)果
一,、各組小鼠骨組織形態(tài)的比較
Micro-CT三維重建圖像顯示假手術(shù)組骨小梁較多，模型組骨小梁明顯減少,，中藥組較模型組骨小梁增加,。見圖1。定量分析結(jié)果顯示,，假手術(shù)組骨體積分數(shù)(BV/TV),、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)高于模型組和中藥組,，而中藥組BV/TV,、Tb.N、Tb.Th高于模型組,，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),。見表1,。
圖1 各組小鼠脛骨Micro-CT三維重建橫斷面
表1 各組小鼠Micro-CT檢測結(jié)果比較
二、各組小鼠骨組織破骨細胞數(shù)量的比較
骨組織TRAP染色及定量分析顯示,，模型組TRAP陽性表達的數(shù)目高于假手術(shù)組和中藥組,，而假手術(shù)組TRAP陽性表達的數(shù)目少于中藥組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),。見圖2～圖3,。
圖2 各組小鼠TRAP染色結(jié)果(×40)
圖3 各組小鼠破骨細胞定量分析比較
四、各組小鼠股骨遠端干骺端CD31,、EMCN陽性表達血管比較
應(yīng)用CD31,、EMCN對股骨遠端干骺端進行熒光雙標(biāo)以檢測H血管的形成情況，結(jié)果顯示模型組干骺端H血管的比例相比假手術(shù)組明顯減少,，中藥組干骺端H血管的比例較模型組增加,，但低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),。提示補充腎活躍血方可以促進去勢骨質(zhì)疏松小鼠干骺端血管的形成,。見圖4。
圖4 各組小鼠干骺端骨組織 CD31 + EMCN 陽性面積比較
五,、各組小鼠血清骨代謝指標(biāo)比較
表2 各組小鼠血清PINP,、TRACP水平比較
結(jié)果
補充腎活躍血方可通過促進骨-血管形成,增加骨生成,減少骨吸收,提高去勢骨質(zhì)疏松小鼠的骨量。
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)的主要癥狀為腰背疼痛,、骨畸形和乏力,，中醫(yī)視其為“骨痿”“骨痹”，認為與腎虛血瘀有關(guān),。女子絕經(jīng)后腎精虧虛,，導(dǎo)致骨骼生長維系受影響，形成腎虛血瘀的惡性循環(huán),。補充腎活躍血是醫(yī)治PMOP的重要原則,，補充腎活躍血方通過補充腎健骨、活躍血祛瘀達到醫(yī)治效果,，研究顯示它能增加去勢骨質(zhì)疏松小鼠的骨量和骨小梁數(shù)量及厚度,。
近年來，研究發(fā)現(xiàn)H型血管與骨生長密切相關(guān),，H血管減少是PMOP的危險因素。骨質(zhì)疏松女性血管內(nèi)皮生長因子表達水平較低,，與骨形成指標(biāo)和骨密度正相關(guān),。促進H血管形成可以抑制破骨細胞功能，增加骨形成,，預(yù)防和醫(yī)治PMOP,。
本文內(nèi)容來源：
https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=ifIT5_n5_GcV1J_62qIHt2mBULHLQLCH4IWu6b64IT-78Jz0V-qsV_jEX9rQg4MkMVNFmmiGcMSeGcofaLVoYoFta95NF_7dxzSaw4pKVV3dVneVV9Stp1xYCEFSyzqDMOJ88t1_3boQq7t4WlNQ0GlGIknHwpDg9FafXnFJjp8J1zw64PRwHODibLrhrDzgM_vj567UCeOt8rqmHfOypw==&uniplatform=NZKPT
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