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20005152--illumina Infinium® Omni5-4 v1.2 Kit 用戶指南
超高檢測通量：可同時(shí)檢測超過 500 萬個(gè)遺傳變異位點(diǎn),，一次實(shí)驗(yàn)即可獲取大量的基因組信息，極大地提高了研究效率,，適用于大規(guī)模的全基因組研究和復(fù)雜疾病的多因素分析 ,。
高準(zhǔn)確性與可靠性：經(jīng)過嚴(yán)格的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，Infinium 技術(shù)具有的準(zhǔn)確性和重復(fù)性 ,。通過對多個(gè)重復(fù)樣本的檢測驗(yàn)證,，該試劑盒的基因型一致性可達(dá) 99% 以上，能夠?yàn)榭蒲薪Y(jié)果提供可靠的數(shù)據(jù)支持,。
廣泛的位點(diǎn)覆蓋：涵蓋了國際通用的基因組參考數(shù)據(jù)庫（如 dbSNP,、1000 Genomes Project 等）中的大量功能性和常見變異位點(diǎn)，同時(shí)也包含了針對特定人群,、疾病或研究領(lǐng)域優(yōu)化的位點(diǎn),，確保對關(guān)鍵遺傳信息的全面捕獲 。
靈活的應(yīng)用范圍：不僅適用于人類樣本的基因分型研究,，也可通過適當(dāng)?shù)恼{(diào)整應(yīng)用于其他物種的遺傳分析 ,。無論是基礎(chǔ)科研、臨床研究還是藥物研發(fā),，都能為研究人員提供有價(jià)值的基因組數(shù)據(jù),。
配套的數(shù)據(jù)分析工具：Illumina 提供了一系列配套的數(shù)據(jù)分析軟件（如 GenomeStudio、BlueFuse Multi 等）,，這些軟件操作簡便,，功能強(qiáng)大，可幫助科研人員快速,、準(zhǔn)確地進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,、基因型分析和結(jié)果可視化 ,。從原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制到復(fù)雜的 CNV 分析,，都能得到一站式的解決方案。
樣本準(zhǔn)備：
樣本類型：該試劑盒適用于多種樣本類型，包括新鮮全血,、EDTA 抗凝全血,、口腔拭子,、FFPE（福爾馬林固定石蠟包埋）組織等 ,。但不同樣本類型的處理方法有所差異，需根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的樣本,。
DNA 提取：使用高質(zhì)量的 DNA 提取試劑盒,，按照說明書的操作步驟從樣本中提取基因組 DNA 。提取后的 DNA 需進(jìn)行濃度和純度測定,，建議使用 Nanodrop 分光光度計(jì)或 Qubit 熒光定量儀檢測,。DNA 濃度應(yīng)在 50 - 200 ng/μL 之間，A260/A280 比值應(yīng)在 1.8 - 2.0 之間,，以確保 DNA 質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求,。
試劑與耗材準(zhǔn)備：
試劑盒檢查：收到 Illumina Infinium® Omni5-4 v1.2 Kit 后，立即檢查試劑盒包裝是否完好,，確認(rèn)各試劑組分是否齊全,，包括 DNA 處理試劑、雜交試劑,、延伸試劑,、洗滌緩沖液、芯片等 ,。查看試劑的有效期,，確保在有效期內(nèi)使用。將試劑盒短暫離心（低速,，如 2000 - 3000 rpm,，離心 1 - 2 分鐘），使附著在管蓋上的試劑集中于管底,。
其他耗材：準(zhǔn)備無菌的 PCR 管,、移液器吸頭、離心機(jī),、振蕩混合器,、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱等實(shí)驗(yàn)耗材和設(shè)備 ,。確保所有耗材均為無菌,、無核酸酶污染狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)設(shè)備運(yùn)行正常,。
實(shí)驗(yàn)環(huán)境準(zhǔn)備：在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,，對實(shí)驗(yàn)室工作臺面進(jìn)行清潔和消毒，使用 75% 酒精擦拭臺面 ,。確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度和濕度穩(wěn)定,，避免環(huán)境因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)過程中,，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全和無菌操作規(guī)范,，防止樣本污染。
DNA 處理：
亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化（可選,，用于甲基化研究或作為預(yù)處理步驟）：取適量提取的 DNA 樣本,，按照試劑盒說明書中的操作步驟進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 。該過程包括 DNA 變性,、亞硫酸氫鹽處理,、中和及純化等步驟，將未甲基化的 C 轉(zhuǎn)化為 U,，同時(shí)保留樣本的 DNA 完整性,。轉(zhuǎn)化后的 DNA 需進(jìn)行定量和質(zhì)量檢測，確保轉(zhuǎn)化效率達(dá)到 90% 以上,。
DNA 片段化與標(biāo)記：將處理后的 DNA 進(jìn)行片段化處理,，使其成為適合與芯片探針雜交的片段長度 。然后,，對 DNA 片段進(jìn)行標(biāo)記,，通常采用末端標(biāo)記的方法，在 DNA 片段的末端添加特定的標(biāo)簽,，以便后續(xù)與芯片探針結(jié)合,。
雜交：將標(biāo)記好的 DNA 樣本與雜交緩沖液混合均勻，加入到 Infinium® Omni5-4 v1.2 芯片的反應(yīng)孔中 ,。將芯片放入雜交爐中,，按照設(shè)定的溫度和時(shí)間進(jìn)行雜交反應(yīng)（一般為 48 - 72 小時(shí)）。在雜交過程中,，DNA 片段會(huì)與芯片上的探針特異性結(jié)合,，形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。
洗滌：雜交完成后,，將芯片從雜交爐中取出,，放入洗滌工作站中，使用洗滌緩沖液進(jìn)行多次洗滌 ,。洗滌過程旨在去除未結(jié)合的 DNA 片段和雜質(zhì),，確保芯片上只保留與探針特異性結(jié)合的 DNA。洗滌步驟需嚴(yán)格按照說明書操作,，控制洗滌時(shí)間和溫度,，以保證洗滌效果。
單堿基延伸：向芯片反應(yīng)孔中加入 DNA 聚合酶和帶有熒光標(biāo)記的 ddNTP,，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng) ,。在合適的溫度和反應(yīng)時(shí)間下（一般為 37℃孵育 2 - 4 小時(shí)）,，DNA 聚合酶根據(jù)目標(biāo)位點(diǎn)的堿基類型，將對應(yīng)的 ddNTP 添加到探針上,，完成單堿基延伸,。
熒光檢測：延伸反應(yīng)結(jié)束后，將芯片放入 Illumina iScan 等熒光掃描儀中進(jìn)行掃描 ,。掃描儀會(huì)根據(jù)熒光標(biāo)記的不同顏色和強(qiáng)度,，對每個(gè)位點(diǎn)的信號進(jìn)行檢測和記錄，生成原始數(shù)據(jù)文件,。
數(shù)據(jù)導(dǎo)入：將掃描得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入 Illumina GenomeStudio 等數(shù)據(jù)分析軟件中 ,。軟件會(huì)自動(dòng)識別數(shù)據(jù)文件中的信息，并將其轉(zhuǎn)換為可分析的格式,。
質(zhì)量控制：在數(shù)據(jù)分析前,，需對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制 。通過軟件中的質(zhì)控模塊,，檢查樣本的整體信號強(qiáng)度,、檢出率、SNP 分型聚類情況等指標(biāo),，剔除質(zhì)量不合格的樣本和位點(diǎn),。一般要求樣本的檢出率大于 95%，SNP 分型聚類清晰,，信號強(qiáng)度均勻,。
基因型分析：使用軟件的基因型分析模塊，對經(jīng)過質(zhì)量控制的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因型 calling ,。軟件會(huì)根據(jù)熒光信號的強(qiáng)度和顏色組合,，自動(dòng)判斷每個(gè)位點(diǎn)的基因型，并生成基因型數(shù)據(jù)表格 ,。對于不確定的基因型,，可通過手動(dòng)調(diào)整聚類邊界或參考其他樣本的基因型進(jìn)行修正。
CNV 分析（可選）：如果需要進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析,，可使用 BlueFuse Multi 等專門的 CNV 分析軟件 ,。將基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件后，通過與參考基因組進(jìn)行比對,，分析樣本中目標(biāo)區(qū)域的拷貝數(shù)變化情況,，并生成 CNV 分析報(bào)告。
結(jié)果解讀與可視化：根據(jù)研究目的,，對基因型和 CNV 分析結(jié)果進(jìn)行解讀 ,。可使用軟件中的可視化工具，生成聚類圖,、曼哈頓圖,、熱圖等，直觀展示研究結(jié)果,。同時(shí),，結(jié)合生物學(xué)背景知識和研究假設(shè)，對結(jié)果進(jìn)行深入分析和討論,，挖掘潛在的遺傳信息。
試劑與耗材處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,，將剩余的試劑按照要求保存于 - 20℃冰箱中,，避免反復(fù)凍融 。對于已開封的試劑,，需盡快使用,，并在使用前檢查試劑是否有變質(zhì)或污染的跡象。使用過的耗材（如 PCR 管,、吸頭,、芯片等）屬于生物廢棄物，應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)定進(jìn)行分類處理,，進(jìn)行高壓滅菌或化學(xué)消毒后丟棄,。
數(shù)據(jù)存儲(chǔ)與備份：將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和分析結(jié)果進(jìn)行妥善存儲(chǔ)，建議使用專用的服務(wù)器或硬盤進(jìn)行備份 ,。同時(shí),，對數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的命名和分類，以便后續(xù)查詢和使用,。為了確保數(shù)據(jù)的安全性,，定期對數(shù)據(jù)進(jìn)行備份，并建立數(shù)據(jù)恢復(fù)機(jī)制,。
樣本質(zhì)量：樣本的質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，確保提取的 DNA 濃度和純度符合要求，避免樣本降解和污染 ,。對于 FFPE 組織樣本,，由于 DNA 質(zhì)量可能較差，需特別注意提取方法和質(zhì)量檢測,，必要時(shí)可進(jìn)行多次提取和純化,。
試劑使用：嚴(yán)格按照說明書要求的儲(chǔ)存條件保存試劑，避免試劑因儲(chǔ)存不當(dāng)而失效 ,。使用試劑時(shí),，應(yīng)使用無菌的移液器和吸頭，避免交叉污染。每次取試劑后,，及時(shí)將試劑管蓋緊,，放回冰箱保存。不同批次的試劑可能存在差異,，盡量使用同一批次的試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。
實(shí)驗(yàn)操作：實(shí)驗(yàn)過程中,，嚴(yán)格遵守操作步驟和時(shí)間要求,，確保每個(gè)步驟的準(zhǔn)確性和一致性 。在進(jìn)行 DNA 處理,、雜交,、洗滌等操作時(shí)，要注意避免樣本蒸發(fā)和污染,。同時(shí),，保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的清潔和穩(wěn)定，減少外界因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,。
數(shù)據(jù)分析：在數(shù)據(jù)分析過程中,，要注意選擇合適的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和分析方法 。對于不確定的結(jié)果,，需進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證和分析,。同時(shí)，保護(hù)數(shù)據(jù)的隱私和安全,，遵守相關(guān)的數(shù)據(jù)管理規(guī)定,。
樣本檢出率低：
原因：可能是樣本 DNA 質(zhì)量不佳、DNA 濃度過低,、雜交條件不合適,、洗滌過度等 。
解決方法：重新檢測樣本 DNA 的濃度和純度,，確保其符合實(shí)驗(yàn)要求,；適當(dāng)增加 DNA 上樣量；優(yōu)化雜交條件,，如調(diào)整雜交溫度,、時(shí)間和雜交液配方；檢查洗滌步驟,，減少洗滌次數(shù)或降低洗滌強(qiáng)度,，避免過度洗滌導(dǎo)致結(jié)合的 DNA 丟失 。
SNP 分型聚類不清晰：
原因：可能是熒光信號強(qiáng)度不足,、探針設(shè)計(jì)不合理,、樣本存在污染,、實(shí)驗(yàn)操作誤差等 。
解決方法：檢查熒光掃描儀的參數(shù)設(shè)置,，確保信號檢測的準(zhǔn)確性,；重新評估探針的設(shè)計(jì)，選擇特異性更高的探針,；對樣本進(jìn)行污染檢測,，如檢測是否存在外源 DNA 污染；仔細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)操作步驟,，避免操作誤差,，如確保試劑添加準(zhǔn)確、混合均勻等 ,。
CNV 分析結(jié)果異常：
原因：可能是參考基因組選擇不當(dāng),、數(shù)據(jù)分析參數(shù)設(shè)置不合理、樣本存在批次效應(yīng)等 ,。
解決方法：根據(jù)研究物種和樣本類型，選擇合適的參考基因組,；優(yōu)化 CNV 分析軟件的參數(shù)設(shè)置,，如調(diào)整閾值、滑動(dòng)窗口大小等,；對樣本進(jìn)行批次效應(yīng)校正,，如使用 ComBat 等軟件進(jìn)行處理 。
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