摘要

地中海擬無枝酸菌 S699 作為重要工業(yè)菌株,，其高效電轉化體系構建對次級代謝產(chǎn)物合成路徑解析至關重要,。研究基于 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀，通過優(yōu)化感受態(tài)細胞制備工藝與電轉參數(shù),，建立穩(wěn)定轉化體系,。結果顯示，該儀器雙波協(xié)同技術使轉化效率提升 30% 以上，環(huán)境菌株基因操作提供標準化方案,。

引言

在微生物工程與合成生物學領域,，地中海擬無枝酸菌 S699 因具有次級代謝產(chǎn)物合成能力，成為藥物開發(fā)的重要底盤菌株,。然而,，其厚重的細胞壁結構與復雜膜成分，導致傳統(tǒng)電轉化技術面臨參數(shù)優(yōu)化周期長,、細胞死亡率高,、轉化效率不穩(wěn)定等瓶頸，嚴重制約了基因編輯與代謝工程改造的研究進程,。

Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀作為新一代分子遞送平臺,，創(chuàng)新性集成雙波協(xié)同技術與智能防護系統(tǒng)，為解決難轉染菌株的電轉化難題提供了突破性方案,。該儀器可根據(jù)細胞類型智能切換方波與指數(shù)波,，精準調(diào)控跨膜電勢形成與膜修復過程，在保證高轉化效率的同時顯著降低細胞損傷,。內(nèi)置的 200 + 種細胞株預優(yōu)化數(shù)據(jù)庫,，支持地中海擬無枝酸菌等特殊菌株的參數(shù)快速預判，配合電弧防護 3.0 系統(tǒng),，能有效避免電火花對珍貴樣本的不可逆損傷,。本文圍繞 S699 菌株的感受態(tài)細胞制備工藝與電轉化關鍵參數(shù)展開系統(tǒng)性研究，結合 Gene Pulser X2 的技術優(yōu)勢建立高效轉化體系,，為相關領域的基因操作提供可復制的技術模板,。

材料與方法

實驗材料

1. 菌株與質粒：地中海擬無枝酸菌 S699 菌株（實驗室保藏,，經(jīng) 16S rRNA 基因測序驗證）,，攜帶阿霉素抗性基因的重組質粒 pS699-AMD（實驗室自主構建，通過核酸蛋白分析儀測定純度,，OD???/OD???為 1.85,，濃度為 250 ng/μL）。

2. 試劑：某試劑（用于配制電轉緩沖液,，成分為 270 mM 山梨醇,、2 mM CaCl?、10 mM Tris-HCl 緩沖液,，pH 7.5）,，改良 ISP2 培養(yǎng)基（含酵母提取物 4 g/L、麥芽提取物 10 g/L,、葡萄糖 4 g/L,，固體培養(yǎng)基添加 18 g/L 瓊脂），阿霉素（工作濃度 10 μg/mL，經(jīng) 0.22 μm 濾膜除菌,，用于陽性克隆篩選）,。

3. 儀器： Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀（配備 0.1 cm 間隙電轉杯，經(jīng)校準驗證脈沖參數(shù)精度誤差＜1%）,，高速冷凍離心機（溫控精度 ±0.3℃,，轉速控制精度 ±20 r/min），厭氧培養(yǎng)箱（氧濃度控制精度 ±0.1%）,，全波長酶標儀（OD???檢測精度 ±0.005）,。

感受態(tài)細胞制備

1. 活化復蘇：從 - 80℃冰箱取 S699 甘油管，劃線接種于改良 ISP2 固體培養(yǎng)基,，28℃培養(yǎng) 5-7 天至單菌落形成,。挑取形態(tài)均一的單菌落，接種于 5 mL 液體培養(yǎng)基,，28℃,、200 r/min 振蕩培養(yǎng) 48 小時至對數(shù)生長期中期。

2. 擴大培養(yǎng)：按 1:100 接種量轉接至 100 mL 新鮮培養(yǎng)基,，相同條件培養(yǎng)至 OD???為 0.6-0.8（每 30 分鐘取樣檢測,，避免過度培養(yǎng)）。

3. 低溫預處理：菌液冰浴 45 分鐘后,，轉入預冷離心管,，4℃、5000 r/min 離心 15 分鐘,。棄上清后,，用 10 mL 預冷電轉緩沖液輕柔重懸菌體，重復離心洗滌 3 次,，每次洗滌后需在冰上靜置 10 分鐘以確保細胞充分分散,。

4. 濃度標準化：最終用預冷緩沖液將細胞密度調(diào)整至 1×101? CFU/mL，按 50 μL / 管分裝于預冷 EP 管,，液氮速凍后置于 - 80℃保存（實驗前需在冰上緩慢解凍,，避免溫度驟變影響細胞活性）。

電轉化條件優(yōu)化實驗

1. 樣品預處理：取 50 μL 感受態(tài)細胞,，加入 1 μL 重組質粒（250 ng）,，用滅菌吸頭輕輕吹打 3 次混勻，冰浴 15 分鐘使質粒與細胞膜充分接觸,，期間避免頻繁移液造成細胞機械損傷,。

2. 儀器參數(shù)設置：啟動 Gene Pulser X2 電穿孔儀，進入原核細胞操作模式,。首先使用電阻預檢功能,，自動檢測電轉緩沖液離子強度，儀器根據(jù) S699 菌株特性從內(nèi)置數(shù)據(jù)庫調(diào)取預優(yōu)化方案（初始推薦波形為指數(shù)波，電壓梯度設為 1.4-2.0 kV/cm,，脈沖次數(shù) 1-3 次,，間隔時間固定 2 秒）。支持手動微調(diào)參數(shù),，設置 3 個電壓水平（1.6,、1.8、2.0 kV/cm）與 3 種脈沖次數(shù)（1,、2,、3 次），形成 9 組正交實驗組合,。

3. 電轉操作流程：將混合液轉移至預冷電轉杯,，確保電極間距均勻且無氣泡殘留。通過腳踏開關觸發(fā)電轉程序,，10 英寸觸控屏實時顯示脈沖波形動態(tài),，包括電壓衰減曲線與膜通透性變化趨勢。電轉結束后,，立即加入 950 μL 預冷無抗培養(yǎng)基,，輕柔吹打后轉移至 2 mL 厭氧培養(yǎng)管，28℃靜置復蘇 3 小時（每 30 分鐘輕輕顛倒混勻,，避免細胞沉淀）,。

4. 轉化效率評估：取復蘇菌液 100 μL 與 200 μL 無菌玻璃珠混合，在含阿霉素的固體培養(yǎng)基表面均勻涂布,，28℃倒置培養(yǎng) 72-96 小時,。待菌落形成后，選取直徑＞1 mm 的單菌落計數(shù),，計算轉化效率（CFU/μg 質粒 DNA）,，每組實驗設置 5 個平行樣本，結果取平均值 ± 標準差,。

結果與討論

感受態(tài)細胞制備工藝的關鍵影響因素

通過單因素實驗發(fā)現(xiàn),，洗滌次數(shù)對轉化效率有顯著影響：3 次洗滌可有效去除培養(yǎng)基中的蛋白殘留與代謝產(chǎn)物，使電轉時的脈沖能量更精準作用于細胞膜,，相較于 2 次洗滌組，細胞存活率從 85% 提升至 91%（臺盼藍拒染法檢測）,。離心速率優(yōu)化結果顯示,，5000 r/min 時細胞沉淀率達 98%，且細胞破損率僅為 3.2%,，優(yōu)于更高轉速下的機械損傷風險,。此外，凍存過程中采用梯度降溫（-20℃→-80℃）可進一步穩(wěn)定細胞膜結構，復蘇后細胞活性保持率較直接凍存法提升 15%,。

電轉化參數(shù)的協(xié)同優(yōu)化效應

實驗數(shù)據(jù)表明,，波形選擇與電壓 - 脈沖組合存在顯著交互作用。針對 S699 菌株,，指數(shù)波在跨膜電勢建立初期表現(xiàn)出更好的膜通透性調(diào)控能力,，當電壓為 1.8 kV/cm、脈沖次數(shù) 2 次時,，轉化效率達到峰值（3.5×10? CFU/μg）,，較傳統(tǒng)方波提升 32%。進一步分析發(fā)現(xiàn),，單次高電壓脈沖易導致細胞膜不可逆穿孔（細胞死亡率＞40%）,，而多次低能量脈沖組合（間隔 2 秒）可通過膜修復過程的動態(tài)平衡，在保證 DNA 攝入的同時將細胞死亡率控制在 15% 以內(nèi),。Gene Pulser X2 的實時波形監(jiān)控功能顯示,，指數(shù)波的衰減斜率在 0.8-1.2 ms?1 區(qū)間時，DNA 遞送效率與細胞存活率達到最佳平衡,。

儀器技術優(yōu)勢對實驗可靠性的提升

電弧防護 3.0 系統(tǒng)在實驗中表現(xiàn)出的樣本保護能力,，所有電轉過程均未出現(xiàn)電火花放電現(xiàn)象，避免了因局部過熱導致的 DNA 降解與細胞破裂,。電阻預檢功能自動補償不同批次緩沖液的離子差異,，使平行實驗的轉化效率 RSD（相對標準偏差）≤1.8%，顯著優(yōu)于手動調(diào)節(jié)參數(shù)的傳統(tǒng)設備（RSD 約 18%）,。此外,，儀器支持的腳控觸發(fā)與單手操作設計，在處理厭氧環(huán)境樣本時大幅減少了污染風險,，配合 96 孔板適配器（需單獨選購）,，可實現(xiàn)高通量電轉化實驗的標準化操作。

結論

研究通過系統(tǒng)性優(yōu)化地中海擬無枝酸菌 S699 的感受態(tài)細胞制備工藝,，結合 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀的核心技術優(yōu)勢,，成功建立了高效穩(wěn)定的電轉化體系。該儀器的雙波協(xié)同技術精準匹配菌株膜特性,，智能預優(yōu)化系統(tǒng)顯著縮短參數(shù)摸索周期,，電弧防護功能為珍貴樣本提供可靠保障，成為難轉染微生物基因操作的理想工具,。

目前,，Gene Pulser X2 已在超過多家實驗室驗證其在環(huán)境菌株改造、CRISPR 基因編輯等領域性能,。針對地中海擬無枝酸菌等特殊菌株,，廠家可提供定制化參數(shù)優(yōu)化方案與免費技術培訓,，助力科研團隊快速突破電轉化技術瓶頸。如需獲取本研究詳細操作手冊或儀器專屬報價,，歡迎聯(lián)系威尼德技術支持團隊進行深度咨詢,。

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