摘要

雙歧桿菌作為重要益生菌,，其高效電轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建對(duì)功能基因研究與工程菌開發(fā)至關(guān)重要,。研究?jī)?yōu)化雙歧桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備工藝，結(jié)合威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀智能波形調(diào)控技術(shù),，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系,。結(jié)果顯示，該儀器通過(guò)預(yù)優(yōu)化程序與動(dòng)態(tài)參數(shù)監(jiān)控，使轉(zhuǎn)化效率提升 35%,，為雙歧桿菌基因操作提供可靠技術(shù)方案,。

引言

在腸道微生物研究與合成生物學(xué)領(lǐng)域，雙歧桿菌的基因編輯與功能解析依賴高效的外源 DNA 導(dǎo)入技術(shù),。電轉(zhuǎn)化法因適用范圍廣,、細(xì)胞損傷小，成為雙歧桿菌遺傳操作方法,。然而,，雙歧桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊，傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化存在參數(shù)摸索周期長(zhǎng),、轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定等問(wèn)題,，制約了其在基因工程中的應(yīng)用。

威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀作為新一代高壓脈沖技術(shù)平臺(tái),，突破了傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)設(shè)備的局限性,。智能指數(shù)衰減波形可精準(zhǔn)調(diào)控電場(chǎng)強(qiáng)度與作用時(shí)間，配合多維度參數(shù)控制模塊,，能針對(duì)雙歧桿菌等難轉(zhuǎn)化菌株優(yōu)化膜通透性,，實(shí)現(xiàn)核酸分子的高效遞送。儀器內(nèi)置的預(yù)優(yōu)化程序庫(kù)包含常見菌種的一鍵式轉(zhuǎn)化方案,，并支持電阻預(yù)檢測(cè)功能,，顯著縮短實(shí)驗(yàn)周期。同時(shí),，10 寸觸控大屏實(shí)時(shí)顯示動(dòng)態(tài)脈沖波形,，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程數(shù)據(jù)透明可追溯，為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件優(yōu)化提供技術(shù)支撐,。本文圍繞雙歧桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及電轉(zhuǎn)化參數(shù)優(yōu)化展開研究,，以期為相關(guān)領(lǐng)域提供標(biāo)準(zhǔn)化操作體系。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

1. 菌株與質(zhì)粒：雙歧桿菌菌株（實(shí)驗(yàn)室保藏,，經(jīng)無(wú)菌驗(yàn)證）,，含氯霉素抗性基因的重組質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建，核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定濃度為 300 ng/μL）,。

2. 試劑：某試劑（用于配制電轉(zhuǎn)緩沖液,，成分為 270 mM 蔗糖、1 mM MgCl?,、5 mM K?HPO?/KH?PO?緩沖液,，pH 7.4），MRS 培養(yǎng)基（含 10 g/L 蛋白胨,、5 g/L 酵母提取物,、10 g/L 葡萄糖,，固體培養(yǎng)基添加 15 g/L 瓊脂），氯霉素（工作濃度 5 μg/mL,，用于陽(yáng)性克隆篩選）,。

3. 儀器：威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀（配備 0.2 cm 間隙電轉(zhuǎn)杯），高速離心機(jī)（冷凍型,，轉(zhuǎn)速精度 ±50 r/min）,，恒溫?fù)u床（溫度控制精度 ±0.5℃，轉(zhuǎn)速范圍 20-500 r/min）,，超凈工作臺(tái)（垂直流送風(fēng),，菌落數(shù)≤5 個(gè) / 皿?時(shí)）。

感受態(tài)細(xì)胞制備

1. 活化培養(yǎng)：從 MRS 固體培養(yǎng)基挑取雙歧桿菌單菌落,，接種于 5 mL MRS 液體培養(yǎng)基（不含抗生素）,，37℃厭氧培養(yǎng) 16-18 小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2. 擴(kuò)大培養(yǎng)：以 1:50 比例轉(zhuǎn)接至 50 mL 新鮮 MRS 培養(yǎng)基,，相同條件培養(yǎng)至 OD???為 0.5-0.7（通過(guò)紫外可見分光光度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)）,。

3. 低溫處理：菌液冰浴 30 分鐘后，4℃,、4500 r/min 離心 10 分鐘,，棄上清。用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液輕柔重懸菌體,，重復(fù)離心洗滌 3 次,，每次洗滌后均需確保細(xì)胞充分分散，避免結(jié)塊,。

4. 濃度調(diào)整：最終用電轉(zhuǎn)緩沖液將細(xì)胞濃度調(diào)整為 2×10? CFU/mL,，分裝至預(yù)冷 EP 管，每管 50 μL,，冰上保存?zhèn)溆?，整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格控制在 4℃以下以維持細(xì)胞活性。

電轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1. 質(zhì)粒與細(xì)胞混合：取 50 μL 感受態(tài)細(xì)胞,，加入 2 μL 重組質(zhì)粒（600 ng），輕輕吸打混勻,，冰浴 10 分鐘,，使質(zhì)粒與細(xì)胞膜充分接觸。

2. 儀器參數(shù)設(shè)置：開啟 Gene Pulser 630 電穿孔儀,，進(jìn)入原核細(xì)胞操作界面,。首先使用電阻預(yù)檢測(cè)功能，自動(dòng)測(cè)量樣品電阻值,，儀器根據(jù)反饋數(shù)據(jù)從內(nèi)置預(yù)優(yōu)化程序庫(kù)中推薦初始參數(shù)組合（包含電壓,、脈沖次數(shù),、間隔時(shí)間等）。支持手動(dòng)微調(diào)參數(shù),，本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置 2-5 個(gè)電壓梯度（1.2-1.8 kV/cm）,，每個(gè)梯度設(shè)置 1-3 個(gè)脈沖次數(shù)（1-3 次），間隔時(shí)間固定為 1 秒,，探索最佳組合,。

3. 電轉(zhuǎn)操作：將混合液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，確保電極間無(wú)氣泡,。腳踏開關(guān)啟動(dòng)電轉(zhuǎn)程序,，10 寸觸控屏實(shí)時(shí)顯示脈沖波形動(dòng)態(tài)，包括電壓衰減曲線與作用時(shí)間,。電轉(zhuǎn)結(jié)束后,，立即加入 950 μL 預(yù)冷 MRS 培養(yǎng)基，輕柔混勻后轉(zhuǎn)移至厭氧培養(yǎng)管,，37℃靜置復(fù)蘇 2 小時(shí),，期間避免劇烈震蕩。

4. 陽(yáng)性克隆篩選：取復(fù)蘇菌液 100 μL 均勻涂布于含氯霉素的 MRS 固體培養(yǎng)基,，厭氧培養(yǎng) 48-72 小時(shí),。觀察菌落形態(tài)，計(jì)數(shù)并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率（CFU/μg 質(zhì)粒 DNA）,，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次取平均值,。

結(jié)果與討論

感受態(tài)細(xì)胞活性對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

通過(guò)優(yōu)化洗滌次數(shù)與離心轉(zhuǎn)速發(fā)現(xiàn)，3 次洗滌可有效去除培養(yǎng)基殘留成分,，避免電轉(zhuǎn)時(shí)離子干擾,；4500 r/min 離心速率既能保證細(xì)胞沉淀，又可減少機(jī)械損傷,。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè),，優(yōu)化后感受態(tài)細(xì)胞存活率達(dá) 92% 以上，為高效轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ),。

電轉(zhuǎn)化參數(shù)的交互作用分析

實(shí)驗(yàn)顯示,，電壓強(qiáng)度是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。在 1.6 kV/cm 電壓下,，單次脈沖轉(zhuǎn)化效率為 1.2×10? CFU/μg,，三次脈沖可提升至 2.1×10? CFU/μg；但過(guò)高電壓（>1.8 kV/cm）會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡率顯著上升,，效率反而下降,。結(jié)合 Gene Pulser 630 的波形實(shí)時(shí)監(jiān)控功能，發(fā)現(xiàn)指數(shù)衰減波在脈沖初期快速形成跨膜電勢(shì),，隨后梯度衰減減少細(xì)胞損傷,，相較于傳統(tǒng)方波,，相同電壓下轉(zhuǎn)化效率提升約 35%。

儀器性能對(duì)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的保障

威尼德電穿孔儀的電弧防護(hù)電路設(shè)計(jì)有效避免了放電過(guò)程中電火花對(duì)細(xì)胞的損傷,，實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)因電弧導(dǎo)致的樣本失效情況,。600 組自定義協(xié)議存儲(chǔ)功能可將優(yōu)化后的雙歧桿菌電轉(zhuǎn)參數(shù)（電壓 1.6 kV/cm、3 次脈沖,、間隔 1 秒）一鍵保存,，后續(xù)實(shí)驗(yàn)直接調(diào)用，不同批次間轉(zhuǎn)化效率波動(dòng)小于 5%,，顯著優(yōu)于手動(dòng)調(diào)節(jié)參數(shù)的傳統(tǒng)設(shè)備（波動(dòng)約 20%）,。腳踏開關(guān)與高通量流程的無(wú)縫銜接，使單批次處理時(shí)間縮短 40%,，尤其適合多參數(shù)平行實(shí)驗(yàn),。

結(jié)論

研究通過(guò)系統(tǒng)性優(yōu)化雙歧桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備工藝，結(jié)合威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀的智能波形調(diào)控與精準(zhǔn)參數(shù)控制技術(shù),，建立了高效,、穩(wěn)定的電轉(zhuǎn)化體系。該儀器憑借預(yù)優(yōu)化程序庫(kù),、實(shí)時(shí)波形監(jiān)控及電弧防護(hù)等核心優(yōu)勢(shì),，解決了難轉(zhuǎn)化菌株的基因遞送難題，為雙歧桿菌的功能基因組研究,、益生菌工程化改造提供了可靠的技術(shù)路徑,。

Gene Pulser 630 在微生物工程、真核細(xì)胞研究等領(lǐng)域均表現(xiàn)出色,，其開放式系統(tǒng)支持未來(lái)技術(shù)升級(jí),，配合免費(fèi)參數(shù)優(yōu)化方案與定制化培訓(xùn)服務(wù)，可助力科研團(tuán)隊(duì)快速突破電轉(zhuǎn)化技術(shù)瓶頸,。如需獲取雙歧桿菌電轉(zhuǎn)化專項(xiàng)技術(shù)方案或儀器詳情,，歡迎聯(lián)系技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)深入探討。

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