關(guān)鍵詞：原代肝細(xì)胞,，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,，肝星狀細(xì)胞,，庫普弗細(xì)胞,，?肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞,，siRNA遞送，肝細(xì)胞自由攝取,，肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染,，primary hepatocytes，Hepatic Stellate Cells, HSCs,，Kupffer Cells,，Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs，Intrahepatic biliary epithelial cells, IBEpiCs,，siRNA delivery,，Cellular Uptake，Hepatocyte siRNA transfection,，ASGPR, GalNAc

肝臟（Liver）是藥物代謝的重要器官,，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ),。其中，原代肝細(xì)胞作為一種肝臟體外模型,，因具有較好的體外試驗(yàn)重現(xiàn)性,，基本維持了肝臟的代謝功能，特別是較好的保留了與體內(nèi)一致的酶水平,，成為了體外藥物試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,，廣泛應(yīng)用于藥物代謝與毒理學(xué)等研究中。原代肝細(xì)胞可分為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞（primary hepatocytes）和肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,，其中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是原代肝細(xì)胞中最主要的組成部分,，約占肝臟細(xì)胞總數(shù)的70%。肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞主要包括肝星狀細(xì)胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）,、庫普弗細(xì)胞（Kupffer Cells）,、?肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs）及肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,IBEpiCs)。本文將簡(jiǎn)要介紹各原代肝細(xì)胞的特點(diǎn)及功能,，以供參考,。

01    原代肝細(xì)胞特點(diǎn)與功能

1    原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞 

原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞（primary hepatocytes）是從動(dòng)物肝臟直接分離的細(xì)胞，是肝臟中最常見的細(xì)胞類型,，約占肝臟細(xì)胞總數(shù)的70%,。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞負(fù)責(zé)代謝、解毒,、合成蛋白質(zhì)及膽汁分泌等核心生理功能,，是肝臟的主要功能細(xì)胞。此外,，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞,，具有豐富的酶系及多種特異性功能。作為一種體外模型,，原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有其它體外模型不可替代的優(yōu)點(diǎn)：

 ① 與體內(nèi)環(huán)境保持一致,，酶量和輔助因子水平都是正常的生理濃度，可以在接近生理狀態(tài)的的情況下研究藥物的代謝和毒性,；

 ② 較好保留和維持了肝細(xì)胞的完整形態(tài)和肝細(xì)胞體外代謝活性,，真實(shí)反應(yīng)了體內(nèi)的代謝情況；

 ③ 無須擔(dān)心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理問題,，亦可減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需要的的成本開支,，實(shí)現(xiàn)了減少（Reduction）、替代（Replacement）,、優(yōu)化（Refinement）的3R倫理原則,。

原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞被分離后，可進(jìn)行貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng),。懸浮培養(yǎng)的原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在最開始的4h內(nèi)細(xì)胞色素P450酶的活性和體內(nèi)最為一致,，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速下降,，故僅適合短期的懸浮代謝應(yīng)用，如藥物攝取,、代謝穩(wěn)定性、代謝產(chǎn)物鑒定和代謝物譜研究等,。貼壁培養(yǎng)的原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞有足夠的時(shí)間從損傷中恢復(fù)過來,，具有正常細(xì)胞的形態(tài)特征，應(yīng)用范圍相對(duì)較廣,，較常見的為細(xì)胞毒性研究,、酶誘導(dǎo)研究、慢代謝藥物的代謝穩(wěn)定性,、代謝產(chǎn)物鑒定等研究,。

SD大鼠懸浮原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞

貓貼壁原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞

此外，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜表面高度特異性表達(dá)去唾液酸糖蛋白受體 (asialoglycoprotein receptor,，ASGPR),，一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中平均表達(dá)500,000個(gè)ASGPR。ASGPR與GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）具有很高的親和力,，而GalNAc是目前siRNA等小核酸藥物最-常用的遞送系統(tǒng),，GaINAc-siRNA偶聯(lián)物通過特異性結(jié)合ASGPR，在細(xì)胞內(nèi)吞作用下,，將siRNA從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中,，從而實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞靶向遞送。因此,，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞還常用于siRNA遞送（siRNA delivery）,、肝細(xì)胞自由攝取（Cellular Uptake）及肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染（Hepatocyte siRNA transfection）等試驗(yàn),。

2    原代肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞

【肝星狀細(xì)胞Hepatic Stellate Cells, HSCs】

肝星狀細(xì)胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）占肝臟固有細(xì)胞總數(shù)的15%,，占非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的30%左右。HSC位于Disse間隙內(nèi),，緊貼著肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（sinusoidal endothelial cells,SEC）和肝細(xì)胞,。其形態(tài)不規(guī)則，呈梭形或多邊形,，常伸出數(shù)個(gè)星狀胞突包繞著肝血竇,。HSC胞質(zhì)內(nèi)有1～14個(gè)直徑約1.0～2.0μm的富含維生素A和甘油三酯的脂滴，胞漿中有豐富的游離核糖體,、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體,。胞核形態(tài)不規(guī)則，由于脂滴的擠壓,，常致細(xì)胞核有一個(gè)或多個(gè)凹陷,，核內(nèi)可見1～2個(gè)核仁,。

肝星狀細(xì)胞 來源于網(wǎng)絡(luò)

正常情況下肝星狀細(xì)胞呈靜息狀態(tài)，它在肝臟中的生理功能主要是參與維生素A的代謝,，儲(chǔ)存脂肪,，肝星狀細(xì)胞的胞漿中含有類視黃醇物質(zhì)的脂滴，是維生素A的主要儲(chǔ)存處,，肝星狀細(xì)胞還有調(diào)節(jié)血管和肝竇血流的作用,。此外，肝星狀細(xì)胞可分泌R-spondin 3（RSPO3）,，通過WNT/β-catenin信號(hào)通路維持肝細(xì)胞代謝分區(qū)（如CYP450酶空間分布）,，保障解毒、糖脂代謝等功能,。RSPO3的缺失將直接導(dǎo)致肝細(xì)胞代謝“地圖”混亂,，再生與修復(fù)能力失調(diào)。

當(dāng)肝臟受到炎癥或機(jī)械刺激等損傷時(shí),，肝星狀細(xì)胞被激活,，其表型由靜息型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚汀＜せ畹母涡菭罴?xì)胞一方面通過增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建,，另一方面通過細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高,。這兩類變化最終奠定了肝纖維化、門靜脈高壓癥發(fā)病的病理學(xué)基礎(chǔ),。

【庫普弗細(xì)胞（Kupffer cell）】

庫普弗細(xì)胞（Kupffer cell,、Browicz-Kupffer cell、stellate macrophages,，亦稱為肝巨噬細(xì)胞）是位于肝臟中的特殊巨噬細(xì)胞,，是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的一部分。庫普弗細(xì)胞的發(fā)育來自骨髓,，由前單核細(xì)胞（promonocytes）,、原單核細(xì)胞（Monoblast）、單核細(xì)胞發(fā)育而來,，血液中的單核細(xì)胞再進(jìn)一步在肝竇壁發(fā)育成庫普弗細(xì)胞,。庫普弗細(xì)胞可通過吞噬作用清除血循環(huán)中異物顆粒或紅細(xì)胞,。

庫普弗細(xì)胞 來源于網(wǎng)絡(luò)

庫普弗細(xì)胞（Kupffer cell）的核心功能包括：

 ?? 免疫防御 

清除異物?：通過吞噬作用清除血液中的病原體,、抗原-抗體復(fù)合物及細(xì)胞碎片?。

補(bǔ)體介導(dǎo)清除?：表面CRIg受體可識(shí)別并清除補(bǔ)體結(jié)合的病原體,，在先天免疫中起關(guān)鍵作用,。?

 ?? 代謝調(diào)控 

· 分解衰老紅細(xì)胞，回收鐵離子,，并將膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞處理,，最終通過膽汁排出,。?

另外庫普弗細(xì)胞表面存在著多種受體，可被多種配體激活,，通過產(chǎn)生細(xì)胞因子,、炎癥介質(zhì)和活性氧等，在多種肝細(xì)胞損傷的發(fā)病過程中起到重要的作用,。

① 肝纖維化

活化的庫普弗細(xì)胞通過釋放促炎因子（如IL-6,、TNF-α）和活性氧，加劇肝細(xì)胞損傷及纖維化進(jìn)程,，肝纖維化模型中可見庫普弗細(xì)胞顯著增生。

② 非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）

庫普弗細(xì)胞通過調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與NAFLD發(fā)病,，抑制其活化可有助于減輕或阻止非酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展。??

【肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs）】

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs）是構(gòu)成肝竇壁的主要非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,，占肝臟細(xì)胞總數(shù)的15%-20%,，具有獨(dú)-特的窗孔結(jié)構(gòu)（直徑100-150 nm），缺乏基底膜,，直接與肝細(xì)胞接觸,，形成肝血竇與Disse腔的物質(zhì)交換界面。 LSECs的窗孔數(shù)量和大小可隨生理狀態(tài)（如年齡,、疾病,、毒素暴露）動(dòng)態(tài)變化。?

?肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells, LSECs）的核心功能包括：

 ?? 物質(zhì)交換和代謝調(diào)控 

·通過窗孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)脂蛋白,、代謝產(chǎn)物在血液與肝細(xì)胞間的雙向運(yùn)輸,，維持肝臟代謝穩(wěn)態(tài)。

· 分泌一氧化氮（NO）調(diào)節(jié)肝竇血管張力,，改善肝臟微循環(huán),。

 ?? 免疫調(diào)節(jié)作用 

· 作為抗原呈遞細(xì)胞（APCs），LSECs通過MHC II類分子激活T細(xì)胞,，誘導(dǎo)免疫耐受,。

· 與Kupffer細(xì)胞協(xié)同清除病原體，并通過釋放IL-10抑制過度炎癥反應(yīng),。

此外,，?肝竇內(nèi)皮細(xì)胞在多種肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演重要的角色：

① 肝纖維化

      慢性損傷導(dǎo)致LSECs窗孔減少并形成基底膜，激活肝星狀細(xì)胞（HSCs）分泌ECM,，促進(jìn)肝纖維化?,。另外，LSECs可分泌TGF-β和PDGF,，直接激活HSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,。?

② 非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）

LSECs窗孔丟失導(dǎo)致脂蛋白滯留，加劇肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和氧化應(yīng)激?,。相關(guān)研究顯示NAFLD患者中LSECs的促炎因子（如IL-6）表達(dá)顯著升高,，與疾病進(jìn)展正相關(guān)。?

【肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,IBEpiCs】

肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,IBEpiCs)是構(gòu)成肝內(nèi)膽管系統(tǒng)的主要功能細(xì)胞,，分布于肝內(nèi)二級(jí)膽管及其分支以上的膽管系統(tǒng),，主要覆蓋肝左葉和右葉的膽管分叉處?。細(xì)胞呈立方或柱狀,，緊密排列形成膽管腔,，表面具有微絨毛以增加吸收面積。IBEpiC負(fù)責(zé)膽汁的分泌,、修飾和運(yùn)輸,，其功能與病理機(jī)制的研究對(duì)肝膽系統(tǒng)疾病的診療具有重要意義。

肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,IBEpiCs)的核心功能包括：

① 膽汁分泌與修飾：分泌碳酸氫鹽和水分,，調(diào)節(jié)膽汁酸堿度（pH 7.6-8.6）,，促進(jìn)脂質(zhì)消化。

② 物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)：通過離子通道（如CFTR氯離子通道）和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控電解質(zhì)平衡,。

③ 免疫屏障：分泌IgA和黏蛋白（MUC5AC）,，抵御病原體入侵膽管系統(tǒng)。

   此外,，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞在肝膽系統(tǒng)相關(guān)疾病的病例過程中具有重要作用：

① 原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）：慢性炎癥影響肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞功能,，導(dǎo)致膽管纖維化狹窄，與免疫異常（如Th17細(xì)胞活化）相關(guān),。

② 肝內(nèi)膽管癌（ICC）：占肝癌的10%-15%,，危險(xiǎn)因素包括肝吸蟲感染、膽管結(jié)石,，常見驅(qū)動(dòng)基因突變（KRAS,、IDH1/2、FGFR2融合）,。這類腫瘤起源于膽管上皮細(xì)胞而非肝細(xì)胞?,，與肝細(xì)胞癌（HCC）相比，ICC在組織學(xué)起源（膽管上皮細(xì)胞）和臨床表現(xiàn)（如早期癥狀隱匿,、晚期易轉(zhuǎn)移）上存在顯著差異?,。

綜上所述，肝臟是人體代謝,、解毒和免疫的核心器官,，其功能依賴于?肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞（primary hepatocytes）、肝星狀細(xì)胞（HSCs）、庫普弗細(xì)胞（KCs）,、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）及肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（IBEpiCs）等多種細(xì)胞的協(xié)同作用,。研究這些關(guān)鍵細(xì)胞類型的意義不僅在于揭示肝臟生理機(jī)制，更對(duì)疾病診療,、再生醫(yī)學(xué)和藥物開發(fā)具有深遠(yuǎn)影響,。

02    IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

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