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實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 mRNA-LNP的體外評(píng)估方法：

1. 未攝取 mRNA（Cy5（-）/EGFP（-）
2. 空白（即預(yù)期無(wú)細(xì)胞的象限）（Cy5（-）/EGFP（+）
3. 已攝取了 mRNA 但尚未翻譯（Cy5(+) / EGFP(-)）
4. 這兩種細(xì)胞都攝取了 mRNA 并將其翻譯成了蛋白質(zhì)（Cy5(+) / EGFP(+)）。
   

2.2 機(jī)制研究方法：

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 向 96 孔板中加入 100 μL濃度為每 100 μL 1×10? 個(gè)細(xì)胞的 HepG2 細(xì)胞。在 37°C,、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜,，使細(xì)胞附著于培養(yǎng)板底。

2. 用 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基（含 10%胎牛血清和 1%青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基）將 FLuc mRNA LNPs 稀釋至最終濃度為 500 ng/mL,。

3. 陽(yáng)性對(duì)照包括裸mRNA 或 Lipofectamine 2000 與 mRNA 的復(fù)合物,。

將 1 mg/ml的FLuc mRNA 用 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至 500 ng/ml。制備Lipofectamine 2000 mRNA 對(duì)照：在 0.6 ml的試管中,，加入 5μL Lipofectamine 2000 于 25 μL的 Opti-MEM 培養(yǎng)基中。在另一個(gè) 0.6 ml的試管中,，加入 5 μL 1 mg/ml的裸露 FLuc mRNA 于 25 μL的 Opti-MEM 培養(yǎng)基中,。將上述溶液混合，在室溫下孵育 5 分鐘,。用 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基將溶液稀釋至最終濃度為 500 ng/ml,。

4. 陰性細(xì)胞活性對(duì)照：在 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋 Triton X-100 以獲得 1%（體積比）的 Triton，作為陰性活性對(duì)照,，以確保檢測(cè)準(zhǔn)確運(yùn)行,。

5. 使用 2 ml的移液器將第1步中 96 孔板中的 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基吸出并丟棄。

6. 向三個(gè)孔（A4 - C4）中加入 100 μL 500 ng/ml的來(lái)自步驟2的FLuc mRNA LNP,，向八個(gè)孔（A2 - H2）中加入 100 μL新鮮的 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基（作為 100% 細(xì)胞活性對(duì)照）,，向三個(gè)孔（A6 - C6）中加入 100 μL 500 ng/ml的裸 FLuc mRNA，向三個(gè)孔（F12 - H12）中加入 100 μL 1%的 Triton,。在 37°C,、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育 24 小時(shí)。

7. 進(jìn)行 alamarBlue 細(xì)胞活性測(cè)定，在一個(gè) 15 ml的試管中,，將 1 ml的 alamarBlue 細(xì)胞活性試劑加入到 9 ml的細(xì)胞培養(yǎng)基中（1：10）,。

8. 使用 2 ml的吸液管將第6步中 96 孔板上的上清液吸出并丟棄。

9. 將步驟7中稀釋的 alamarBlue 溶液倒入 25 ml的試劑儲(chǔ)存器中,。

10. 使用多通道移液器向步驟8中制備的平板的每個(gè)孔中加入 100 μL的 alamarBlue 溶液,。

11. 將 96 孔板轉(zhuǎn)移至 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，在 37°C 下孵育 2 至 4 小時(shí),。

12. 在酶標(biāo)儀中讀取 570 納米處的吸光度和 600 納米處的背景值,。

13. 計(jì)算細(xì)胞活性

14. 在另一塊 96 孔板中，重復(fù)步驟1至6,。向每個(gè)處理過(guò)的孔中加入 100 μL Bright-Glo 熒光素酶檢測(cè)緩沖液,。孵育 3 分鐘，然后在微孔板讀數(shù)儀上讀取發(fā)光值,。

第 2 部分：定量評(píng)估熒光標(biāo)記LNP的細(xì)胞攝取情況

關(guān)鍵信息：在 mRNA 脂質(zhì)納米顆粒配方中加入了 Atto-488 DOPE 分子（步驟 16）,。

15. 用 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至每 100 μL 2×10? 個(gè)細(xì)胞的最終濃度。在 24 孔板的每個(gè)孔中加入 400 μL細(xì)胞,。每個(gè)孔的最終細(xì)胞密度應(yīng)為 8×10? 個(gè)細(xì)胞,。在 37°C、5% CO? 培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜,，以使細(xì)胞附著于基質(zhì),。

16. 使用 Atto-488 DOPE 制備 Atto-488 標(biāo)記的FLuc mRNA-LNP。用細(xì)胞培養(yǎng)基將 Atto-488 標(biāo)記的 FLuc mRNA LNPs 稀釋至最終濃度為 500 ng/mL,。

17. 用 2 ml的吸液管將 24 孔板中的上清液吸出并丟棄,。

18. 每孔向細(xì)胞中加入 400 μL 500 ng/ml的 Atto-488 標(biāo)記的FLuc mRNA LNP。向其他細(xì)胞中加入 400 μL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（作為未染色細(xì)胞對(duì)照）,。在 37°C,、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 24 小時(shí)。

19. 用 DPBS 洗滌細(xì)胞三次,，每次向每個(gè)孔中加入 400 μL DPBS,。孵育 10 秒，然后用2 ml吸液管吸取上清液并丟棄液體,。

20. 用 150 μL 2 倍濃度的胰蛋白酶 - EDTA（10 倍濃度胰蛋白酶 - EDTA 的 1:5 稀釋液）使細(xì)胞分離,，并在 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 5 分鐘。

21. 一旦所有細(xì)胞從培養(yǎng)板上脫落,，向每個(gè)孔中加入 200 μL DPBS,，然后將每個(gè)孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的 1.7 ml管中。

22. 用 DPBS 洗滌細(xì)胞兩次,，每次向每管中加入 400 μL DPBS,，然后以 300g 離心 5 分鐘,，棄去上清液。每次洗滌后,，將細(xì)胞懸浮于 200 μL DPBS 中,。

23. 在流式細(xì)胞儀（如 Attune NxT 流式細(xì)胞儀）上分析樣本。將前向散射光（FSC）電壓設(shè)為 100,，側(cè)向散射光（SSC）電壓設(shè)為 280,，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，以確保能清晰觀察到單細(xì)胞簇,。然后選擇“BL1”通道來(lái)測(cè)量樣本,。

23. 使用 FlowJo（或類似）軟件，通過(guò)與未處理細(xì)胞對(duì)照相比具有更強(qiáng)熒光強(qiáng)度的細(xì)胞百分比或通過(guò)幾何熒光平均強(qiáng)度來(lái)評(píng)估 Atto-488 標(biāo)記的 FLuc mRNA LNPs 的攝取情況,。

第 3 部分：使用熒光標(biāo)記的LNP 的細(xì)胞攝取和蛋白質(zhì)表達(dá)定量評(píng)估

關(guān)鍵在信息：將 Cy5-EGFP mRNA 封裝到所需的 LNP 配方中,，該配方由可離子化脂質(zhì)（SM-102）、磷脂（DOPE）,、膽固醇和 PEG 脂質(zhì)（C14-PEG-2000）以及 Cy5-EGFP mRNA 組成,，制備方法參考上期內(nèi)容。

25. 在 24 孔板中,，重復(fù)步驟15至22,。使用流式細(xì)胞儀（如 Attune NxT 流式細(xì)胞儀）分析樣本。將前向散射光（FSC）電壓設(shè)為 100,，側(cè)向散射光（SSC）電壓設(shè)為 280,，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，以確保能清晰觀察到單細(xì)胞簇,。然后選擇“BL1”通道和“RL1”通道來(lái)測(cè)量樣本,。使用 FlowJo 軟件，通過(guò)將樣本分為四個(gè)象限,，以對(duì)照未處理細(xì)胞中熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的細(xì)胞百分比來(lái)評(píng)估 Cy5-EGFP mRNA LNP 的攝取和表達(dá)情況,。

26. 計(jì)數(shù) HepG2 細(xì)胞數(shù)量，然后用 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液,，使最終濃度為每 100 μL 1×104 個(gè)細(xì)胞。向每孔加入 300 μL細(xì)胞,，使最終細(xì)胞密度為每孔 3×104 個(gè)細(xì)胞（在 µ-slide 8 孔蓋玻片載玻片中）,。在 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜,，以使細(xì)胞附著于基質(zhì),。

27. 用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋 Cy5-EGFP mRNA LNP，使其最終濃度為 500 ng/mL,。

28. 用 2 ml的抽吸移液管通過(guò)真空抽吸將 µ-slide 8 孔蓋玻片載玻片上的上清液吸出并丟棄,。

29. 向每個(gè)孔中加入 300 μL 500 ng/ml的 Cy5-EGFP mRNA 脂質(zhì)納米顆粒,。在 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中 37℃孵育 24 小時(shí)。

30. 用 DPBS 洗滌細(xì)胞兩次,，每次向每個(gè)孔中加入 300 μL DPBS,。

31. 在 15 ml的試管中，用 DPBS 將 10 mg/ml的 Hoechst 33342 稀釋至 1 μg/ml,。向每個(gè)孔中加入 300 μL  1μg/ml的 Hoechst 33342,，然后在 37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 10 分鐘,。

32. 重復(fù)步驟30,，將細(xì)胞清洗三次。

33. 向每個(gè)孔中加入 200 μL的 DPBS,。

34. 通過(guò)將 µ-slide 8 孔蓋玻片置于共聚焦激光掃描顯微鏡下進(jìn)行共聚焦顯微鏡活細(xì)胞成像,，以觀察 mRNA LNP 的水平（選擇“Cy5”通道）和 EGFP 表達(dá)（選擇“EGFP”通道）。使用 WCIF Image J 軟件處理圖像,，添加比例尺并合并不同通道（藍(lán)色代表細(xì)胞核,，紅色代表 Cy5-mRNA，綠色代表 EGFP 蛋白）,。

第4部分：內(nèi)體逃逸機(jī)制研究

關(guān)鍵信息：為了量化細(xì)胞內(nèi) mRNA-LNP的內(nèi)體逃逸能力,，有必要在 LNPs 上添加一些熒光標(biāo)記。使用 Atto-488 標(biāo)記的 FLuc mRNA-LNP,。

35. 重復(fù)步驟 26,。

36. 重復(fù)步驟 16。

37. 重復(fù)步驟 28,。

38. 向每個(gè)孔中加入 300 μL 500 ng/ml的 Atto-488 標(biāo)記的熒光素酶 mRNA 脂質(zhì)納米顆粒,。在 37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 4 小時(shí),。

39. 重復(fù)步驟 30,。

40. 在 15 ml的試管中，用細(xì)胞培養(yǎng)基將溶酶體示蹤劑深紅色稀釋至最終濃度為 100 nM,。

關(guān)鍵步驟：將細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)熱至 37 攝氏度,。

41. 向每個(gè)細(xì)胞孔中加入 300 μL 100 nM的稀釋型溶酶體示蹤劑深紅色溶液，然后在 37 攝氏度,、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 1 小時(shí),。

42. 重復(fù)步驟 30。

43. 在 15 ml的試管中,，用 DPBS 將 10 mg/ml的 Hoechst 33342 稀釋至 1 μg/ml,。向每個(gè)孔中加入 300 μL 1 μg/ml的 Hoechst 33342，然后在 37°C,、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 10 分鐘,。

44. 重復(fù)步驟 30,。

45. 向每個(gè)孔中加入 200 μL的 DPBS。

46. 通過(guò)將 µ-slide 8 孔蓋玻片置于共聚焦激光掃描顯微鏡下進(jìn)行活細(xì)胞成像,，以可視化內(nèi)體（選擇“Lysotracker Deep Red”通道）,、細(xì)胞核（選擇“Hoechst 33342”通道）和 Atto-488 標(biāo)記的 FLuc mRNA LNPs（選擇“Atto-488”通道）。需要拍攝五張具有代表性的細(xì)胞圖像（每張圖像包含超過(guò) 20 個(gè)細(xì)胞）來(lái)計(jì)算 PCC 值,。這些圖像可以通過(guò) WCIF Image J 軟件進(jìn)一步處理,，以添加比例尺并合并不同通道（藍(lán)色：細(xì)胞核；紅色：內(nèi)體,；綠色：Atto-488 標(biāo)記的 FLuc mRNA LNPs）,。要獲取 PCC 值，請(qǐng)將共聚焦圖像導(dǎo)入帶有“JACoP”插件的 WCIF ImageJ 軟件,。導(dǎo)航至“插件”,，選擇“JACoP”，然后選擇“皮爾遜相關(guān)系數(shù)”,。選擇圖像 A（綠色通道）和圖像 B（紅色通道）,，然后點(diǎn)擊“分析”。軟件將計(jì)算 PCC 值,。內(nèi)體逃逸能力通過(guò) PCC 進(jìn)行量化,，其中 PCC 值為 1 表示無(wú)內(nèi)體逃逸，而 PCC 值為 0 表示充分內(nèi)體逃逸,。

第5部分：使用巴弗洛霉素 A1 評(píng)估質(zhì)子海綿機(jī)制

關(guān)鍵信息：為了量化細(xì)胞內(nèi) mRNA-LNP的內(nèi)體逃逸能力,，有必要在 LNPs 上添加一些熒光標(biāo)記。使用 Atto-488 標(biāo)記的 FLuc mRNA-LNP,。

47.重復(fù)步驟35至37,，但在步驟36中，按照實(shí)驗(yàn)步驟制備未標(biāo)記熒光素的 FLuc mRNA LNP,。

48. 向三個(gè)孔中加入 180 μL新鮮的 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基,，向另外三個(gè)孔中加入含有巴弗洛霉素 A1（111.1 nM）的新鮮 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)基。

49. 在 1.7 ml的試管中,，稱取 1.5 mg的鈣黃綠素,，然后加入 1 ml的磷酸鹽緩沖鹽水（DPBS），使鈣黃綠素的最終濃度為 1.5 mg/ml,。

50. 向每個(gè)孔中加入 20 μL 1.5 mg/ml的鈣黃綠素,，以獲得 150 μg/ml的鈣黃綠素和 100 nM的巴弗洛霉素 A1 的最終濃度。

51. 向每個(gè)孔中加入 100 μL 1500 ng/ml的 mRNA 脂質(zhì)納米顆粒（以獲得最終濃度為 500 ng/ml的 mRNA 脂質(zhì)納米顆粒）,。向?qū)φ占?xì)胞中加入 100 μL新鮮培養(yǎng)基。在 37°C,、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 4 小時(shí),。

52. 在 4 小時(shí)的孵育期結(jié)束后,，用戶可選擇用 CellMask™ Deep Red Actin 跟蹤染料（方案 A）對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，或用 Hoechst 33342（方案 B）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,，以分別觀察細(xì)胞骨架和細(xì)胞核,。

（A）染色細(xì)胞骨架

（i）在 15 ml的試管中，用細(xì)胞培養(yǎng)基將 CellMask™ Deep Red Actin 跟蹤染料（1 毫摩爾）稀釋至最終濃度為 1 微摩爾,。

（ii）向每個(gè)處理過(guò)的孔中加入 300 μL 1 微摩爾的稀釋 CellMask™ Deep Red Actin 跟蹤染料,。

（iii）在 5% CO2 培養(yǎng)箱中 37°C 孵育 15 分鐘。

（B）染色細(xì)胞核

（i）用 Hoechst 33342 染色細(xì)胞核,，請(qǐng)重復(fù)步驟 54,。

53. 用 DPBS 洗滌細(xì)胞四次，重復(fù)步驟30,。

54. 向每個(gè)孔中加入 200 μL的 DPBS,。

55. 通過(guò)將 µ-slide 8 孔蓋玻片置于共聚焦激光掃描顯微鏡下進(jìn)行活細(xì)胞成像，以共聚焦顯微鏡觀察鈣黃綠素信號(hào)（選擇“鈣黃綠素”通道）,、細(xì)胞核（選擇“Hoechst 33342”通道）和細(xì)胞骨架（選擇“CellMask Deep Red”通道）,。圖像可通過(guò) WCIF Image J 軟件進(jìn)一步處理，以添加比例尺或合并不同通道（藍(lán)色：細(xì)胞核,；紅色：細(xì)胞骨架,；綠色：鈣黃綠素）。

預(yù)期結(jié)果

在HepG2 細(xì)胞的 FLuc 表達(dá)評(píng)估中,，所有 mRNA LNPs 的耐受性均如預(yù)期般良好（圖3a）,，1%的 Triton X-100 使細(xì)胞存活率低于 10%，這表明 alamarBlue 細(xì)胞活力測(cè)定法有效,。在蛋白質(zhì)表達(dá)方面,，ATP LNPs 的 FLuc 表達(dá)量高于其他配方，而 TAT LNPs 和八精氨酸 LNPs 的 FLuc 表達(dá)量較低（圖3b）,。為了評(píng)估細(xì)胞攝取情況,，利用 Atto-488 標(biāo)記的 DOPE制備LNP ，并量化與培養(yǎng)基處理對(duì)照組相比熒光信號(hào)增強(qiáng)的細(xì)胞百分比,。TAT LNPs,、八精氨酸 LNPs 和 TA LNPs 的細(xì)胞攝取量低于 LNP 組（圖3c）。將 Cy5-EGFP mRNA 封裝到 LNP ,，蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞攝取可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量評(píng)估（圖3d,、e），所得結(jié)果與圖3b,、c 中的結(jié)果相似,。通過(guò)這種方法，可以同時(shí)評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞攝取,。為了定性評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞攝取,，可使用共聚焦顯微鏡可視化 Cy5-EGFP mRNA LNPs,，為研究人員提供更直觀、直接的 mRNA LNPs 效果評(píng)估方式,。如圖3f 所示,，ATP LNPs 表現(xiàn)出更高的蛋白質(zhì)表達(dá)，而 TAT LNPs,、八精氨酸 LNPs 和 TA LNPs 則表現(xiàn)出較低的蛋白質(zhì)表達(dá),，這與圖3d、e 中的結(jié)果一致,。

參考文獻(xiàn)：Ma Y, VanKeulen-Miller R, Fenton OS. mRNA lipid nanoparticle formulation, characterization and evaluation. Nat Protoc. 2025 Mar 11. doi: 10.1038/s41596-024-01134-4. Epub ahead of print. PMID: 40069324.