蛋白定量的方法有很多種,，應(yīng)用較多的主要有兩種：BCA蛋白定量檢測法和Bradford蛋白定量檢測法，市售的蛋白定量試劑盒也多基于上述兩種檢測方法而開發(fā)的,。兩種方法均需配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,，蛋白與定量試劑經(jīng)過一定時(shí)間的反應(yīng)（BCA法反應(yīng)為37℃、20-30min,，Bradford法反應(yīng)一般為37℃,，5min），酶標(biāo)儀讀取樣品的OD值,，繪制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算WB蛋白的濃度。

蛋白定量:

取適量上述步驟中未變性的總蛋白溶液,，用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒（G2026-200T,；G2026-1000T）測蛋白濃度，蛋白濃度測定方法如下：

A.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液

取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中,，將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品全溶解,，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長期保存,。

B.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液

取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液,，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液,。注意稀釋時(shí)按照10倍梯度方法稀釋,，確保稀釋準(zhǔn)確。

C.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）

將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0,、1,、2、4,、8,、12、16、20 μL加到96孔板中,，然后用PBS或生理鹽水依次加20,、19、18,、16,、12、8,、4,、0 μL將上述梯度工作液補(bǔ)足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0,、25,、50、100,、200,、300、400,、500 μg/mL的梯度曲線,。

D.準(zhǔn)備待測樣品

將待測的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋（可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測，使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),，確保檢測結(jié)果可信）,，按照每個(gè)樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋,。

E.配制BCA顯色工作液

將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻,，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存,，24 h內(nèi)使用,。每個(gè)待測樣品需200 μL，建議按需配制,，避免浪費(fèi),。

F.檢測

向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s）,，37℃反應(yīng)30 min后,，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定,，記錄各孔吸光度值,。（注：也可以在室溫反應(yīng)2 h，或60℃反應(yīng)30 min,。如果蛋白濃度較低,，建議置于60℃反應(yīng)） 

G.計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標(biāo),，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。根據(jù)所測樣品的吸光值,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實(shí)際蛋白濃度,。

提示：

1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時(shí)間的影響較大,，吸光度值會(huì)隨著時(shí)間的延長或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度,，建議每次測定都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

2. 在進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制時(shí)，需確保溶解充分,。稀釋配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)建議10倍梯度稀釋,，不要一次稀釋50倍，以免產(chǎn)生較大誤差,。

3. 為保證蛋白的精確定量,，樣品的提取和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測條件一致,。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定,。

4. 操作時(shí)請穿實(shí)驗(yàn)服,，并佩戴一次性手套。