Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis

Subject terms: Cell biology, Systems biology

動(dòng)脈粥樣硬化是一種主要影響動(dòng)脈的多因素慢性炎癥性疾病,。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞與血液直接接觸,，并因各種風(fēng)險(xiǎn)因素（如高膽固醇血癥,、糖尿病、高血壓,、吸煙和衰老）而變得功能失調(diào)和發(fā)炎,，尤其是在與血流紊亂相關(guān)的特定動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域。這些區(qū)域的擾動(dòng)流的特征是向內(nèi)皮細(xì)胞表面?zhèn)鬟f低幅度的振蕩剪切應(yīng)力（OSS）,。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)機(jī)械感應(yīng)受體（機(jī)械傳感器）檢測(cè)各種剪切應(yīng)力模式和幅度,，并將這些機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞信號(hào)和隨后的結(jié)構(gòu)和功能反應(yīng)。

在這些內(nèi)皮炎癥部位,，循環(huán)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合并遷移到內(nèi)皮下空間,，分化成巨噬細(xì)胞。這些區(qū)域還顯示出對(duì)循環(huán)低密度脂蛋白（LDL）膽固醇的滲透性增加,，LDL 膽固醇在內(nèi)皮下被氧化并被附近的巨噬細(xì)胞攝取,，從而促進(jìn)泡沫細(xì)胞發(fā)育并引發(fā)炎癥和巨噬細(xì)胞積累的惡性循環(huán)。此外,，這些區(qū)域的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）轉(zhuǎn)化為合成表型并遷移到內(nèi)皮下層增殖,，導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚。一些 VSMCs 轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,，最終導(dǎo)致脂質(zhì)條紋和纖維脂肪斑塊的形成（圖1 a）,。隨著動(dòng)脈粥樣硬化斑塊向外和向內(nèi)生長(zhǎng),、成熟和進(jìn)展，一些斑塊破裂,，導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管事件,，如心肌梗塞和中風(fēng)。

目前,，控制致動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和炎癥的血流調(diào)控（血流敏感）的基因,、蛋白質(zhì)和通路可能成為有希望的新治療靶點(diǎn)。為此,，美國(guó)埃默里大學(xué)-佐治亞理工Wallace H. Coulter生物醫(yī)學(xué)工程系團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)綜述討論了當(dāng)前關(guān)于血流敏感基因,、蛋白質(zhì)和通路的研究進(jìn)展，包括與內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞重編程（FIRE）的新興概念,。研究成果發(fā)表于 Nature Reviews Cardiology 期刊題為“Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis”,。

圖1    動(dòng)脈粥樣硬化優(yōu)先發(fā)生在血流紊亂的部位。

內(nèi)皮細(xì)胞的剪切應(yīng)力

血管內(nèi)皮細(xì)胞不斷暴露在血流動(dòng)力學(xué)力下：血壓引起的動(dòng)脈壁正常（跨壁）應(yīng)力和周向應(yīng)力,，以及血流引起的內(nèi)皮表面的切向剪切應(yīng)力（圖1 b）,。雖然血管壁中的跨壁壓力和周向應(yīng)力主要影響和調(diào)節(jié)內(nèi)側(cè) VSMCs，但流體剪切應(yīng)力主要影響內(nèi)皮細(xì)胞,，有效調(diào)節(jié)其功能,。

由于復(fù)雜的血管幾何形狀和血流動(dòng)力學(xué)條件，血管系統(tǒng)不同區(qū)域的剪切應(yīng)力水平和方向模式差異很大（圖1 c）,。在人體動(dòng)脈的直段,、非分支區(qū)域，血流的粘性力超過(guò)慣性力,，導(dǎo)致穩(wěn)定的單向?qū)恿?，從而向?nèi)皮細(xì)胞提供高幅度的 ULS （~15 dyn/cm2）。相反,，在彎曲和分支區(qū)域,，慣性力變得更加突出，導(dǎo)致紊亂的多向振蕩流,，將低幅度的 OSS（約 ±4 dyn/cm2）輸送到內(nèi)皮細(xì)胞表面（圖1 d）,。

血流的臨床意義在于，動(dòng)脈粥樣硬化優(yōu)先發(fā)生在彎曲或分支的血管區(qū)域,，這些區(qū)域暴露于流動(dòng)受干擾的環(huán)境,，并存在其他危險(xiǎn)因素，如高膽固醇血癥和糖尿病,。

血流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型

臨床觀察強(qiáng)烈表明,，血流紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生部位之間存在相關(guān)性，但其是否直接導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化一直是未知的，直到在動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí),。在部分頸動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)（PCL）模型中，左頸動(dòng)脈（LCA）誘導(dǎo)血流紊亂,，具有典型的低幅度 OSS 模式（圖2 a）,。在高脂飲食誘導(dǎo)高膽固醇血癥的Apoe?/? 小鼠或過(guò)表達(dá)PCSK9的C57BL/6小鼠中，PCL 手術(shù)在 2-3 周內(nèi)導(dǎo)致整個(gè) LCA 長(zhǎng)度的動(dòng)脈粥樣硬化快速發(fā)展,。重要的是,，在該小鼠模型中，對(duì)側(cè)右頸動(dòng)脈（RCA）繼續(xù)暴露于穩(wěn)定的血流中,，且不會(huì)形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,，是同一動(dòng)物的理想對(duì)照（圖2 b）。此外,，收縮頸動(dòng)脈袖帶模型涉及在 RCA 的一部分上植入剪切應(yīng)力修改模型（圖2 b）,，它將 RCA 的該部分暴露于三種不同的剪切應(yīng)力狀態(tài)下：低幅度、穩(wěn)定的血流,，這會(huì)誘導(dǎo)易損斑塊的發(fā)展,；高幅度,、穩(wěn)定的血流,，無(wú)斑塊形成；以及紊亂血流,，這會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性斑塊的發(fā)展,。該小鼠模型顯示了單頸動(dòng)脈內(nèi)血流依賴(lài)性動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展（圖2 b）。這兩種動(dòng)物模型已在全球眾多實(shí)驗(yàn)室中使用,，是研究體內(nèi)血流依賴(lài)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞功能和動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的極其有價(jià)值的工具,。

除了這些受干擾血流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠模型外，斑馬魚(yú)也被用作一種遺傳上易于處理的模型,，用于檢查動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件,。結(jié)合基因操作方法減少血流量，斑馬魚(yú)模型提供了進(jìn)一步的證據(jù),，證明在高膽固醇血癥條件下,，血流紊亂會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。

此外,，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多剪切應(yīng)力的體外模型,，包括錐板粘度計(jì)、平行板流室和微流體通道,。這些體外生物反應(yīng)器將內(nèi)皮細(xì)胞暴露在各種剪切條件下,，可用于在明確的生物力學(xué)環(huán)境中確定剪切應(yīng)力依賴(lài)性?xún)?nèi)皮功能的詳細(xì)機(jī)制（圖2 c、d）。

圖2    血流紊亂誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化模型,。

血流調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能

體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞不斷暴露于各種血流動(dòng)力學(xué)因素,，尤其是與血流相關(guān)的剪切應(yīng)力，它有效地調(diào)節(jié)了內(nèi)皮細(xì)胞功能的幾乎所有方面,。明確穩(wěn)定血流保護(hù)內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)功能和紊亂血流誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制對(duì)于了解血流依賴(lài)性動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的治療方法至關(guān)重要,。

穩(wěn)定流通過(guò)控制緊密連接蛋白表達(dá)和與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的附著來(lái)促進(jìn)緊密連接穩(wěn)定性，以及通過(guò) VE-鈣粘蛋白的磷酸化和降解來(lái)控制粘附連接完整性,，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性,。擾動(dòng)流通過(guò)多種機(jī)制增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，包括下調(diào)腫瘤抑制蛋白 p53 的表達(dá)和抑制抗凋亡激酶AKT,。穩(wěn)定流通過(guò) sirtuin 1 依賴(lài)性和 FOXO1 依賴(lài)性通路誘導(dǎo)自噬,，為內(nèi)皮細(xì)胞提供細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。擾動(dòng)流通過(guò) p53 依賴(lài)性和 sirtuin 1 依賴(lài)性機(jī)制誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞遷移并破壞動(dòng)脈修復(fù)機(jī)制,。

血流還調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的新陳代謝和氧化還原反應(yīng),。雖然穩(wěn)定血流會(huì)降低內(nèi)皮葡萄糖攝取和代謝活性以及編碼糖酵解相關(guān)蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)，但紊亂血流會(huì)促進(jìn)糖酵解代謝,，導(dǎo)致明顯不同的代謝組學(xué)特征和線粒體裂變?cè)黾印_動(dòng)流還增加了內(nèi)皮活性氧（ROS）的生成和氧化應(yīng)激,。在動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓的情況下,，內(nèi)皮響應(yīng)擾動(dòng)流的ROS 生成會(huì)增加血管氧化應(yīng)激和 LDL 氧化。

血流紊亂還有效誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,，這在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,。擾動(dòng)流通過(guò)增加內(nèi)皮粘附分子（VCAM1、ICAM1 和 E-選擇素）的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮炎癥,，這些分子介導(dǎo)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,。此外，擾動(dòng)流促進(jìn)了細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá),，如 IL-1,、IL-6 和 CCL5。血流紊亂可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化（內(nèi)皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變,；EndMT）和免疫樣細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞到免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)變,；EndIT）。

機(jī)械傳感器和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)

內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)位于細(xì)胞頂端和基底表面,、細(xì)胞間連接處和細(xì)胞內(nèi)的機(jī)械傳感器識(shí)別流體剪切應(yīng)力（圖3）,。在頂端表面，機(jī)械傳感器包括質(zhì)膜蛋白,，如陽(yáng)離子通道 PIEZO1 和 P2X 嘌呤受體4,、NOTCH1、蛋白激酶、G 蛋白偶聯(lián)受體和叢狀蛋白D1,，以及膜相關(guān)結(jié)構(gòu),，如小窩、糖萼和初級(jí)纖毛,。

在細(xì)胞間連接處,，血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（PECAM1）、VE-鈣粘蛋白和 VEGFR2 形成連接機(jī)械感覺(jué)復(fù)合物,，該復(fù)合物通過(guò) PI3K-AKT 信號(hào)介導(dǎo)整合素激活,、細(xì)胞排列和 eNOS 激活，以響應(yīng)穩(wěn)定血流,。

在內(nèi)皮細(xì)胞的基底表面,，血流誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合整合素機(jī)械傳感器的構(gòu)象激活和表達(dá)變化。穩(wěn)定的血流會(huì)激活整合素αvβ3,，導(dǎo)致與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合增加,，下游 RHO 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失活。此外,，細(xì)胞質(zhì)中的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架已被證明用作機(jī)械感覺(jué)結(jié)構(gòu),。

圖3     內(nèi)皮細(xì)胞中的機(jī)械傳感器和機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞重編程

該研究人員對(duì) PCL 手術(shù)后同一只小鼠的 LCAs（暴露于擾動(dòng)流 2 天或 2 周）和 RCAs（暴露于穩(wěn)定流 2 天或 2 周）獲得的單細(xì)胞進(jìn)行了研究,，以血流依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性方式鑒定內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞類(lèi)型的差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀基因組變化,。scRNA-seq 和 scATAC-seq 結(jié)果獨(dú)立顯示，擾動(dòng)流以時(shí)間依賴(lài)性方式誘導(dǎo)小鼠頸動(dòng)脈細(xì)胞組成的動(dòng)態(tài)變化,。

頸動(dòng)脈包含八個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞簇,、四個(gè)單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇、一個(gè) VSMC 簇,、一個(gè)成纖維細(xì)胞、一個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞和一個(gè) T 細(xì)胞,，所有這些細(xì)胞在細(xì)胞身份和數(shù)量方面都以血流依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性方式變化,。最有趣的是，頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在響應(yīng)血流時(shí)是異質(zhì)的和動(dòng)態(tài)的,。在暴露于生理穩(wěn)定血流條件下的 RCA 中,，鑒定出四個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞亞簇（E1-E4），并隨著時(shí)間的推移保持不變,。然而,，在暴露于促動(dòng)脈粥樣硬化擾動(dòng)流條件的 LCA 中，大多數(shù)健康的內(nèi)皮細(xì)胞亞簇（E2-E4）幾乎丟失,，而新的內(nèi)皮細(xì)胞亞簇（E6 和 E8）出現(xiàn),。此外，在 RCA 內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)的 VSMCs 很少，但正如預(yù)期的那樣,，紊亂的血流增加了 LCA 中的 VSMCs 數(shù)量,。在 LCA 和 RCA 中均發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞，在 2 天擾動(dòng)流條件下,，LCA 中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最高,。盡管單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞簇在 RCA 中很少見(jiàn)，但 LCA 的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加,，反映出血流紊亂時(shí)血管發(fā)生了實(shí)質(zhì)性的促炎和促動(dòng)脈粥樣硬化改變,。與巨噬細(xì)胞一樣，RCA 中存在很少的樹(shù)突狀細(xì)胞和 T 細(xì)胞,，但它們的數(shù)量因 LCA 中的擾動(dòng)流而增加,。

為了了解擾動(dòng)流誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表型變化的潛在機(jī)制，分析了 8 個(gè)不同的內(nèi)皮細(xì)胞簇的差異基因表達(dá)和基因本體論,。正如預(yù)期的那樣,，典型健康內(nèi)皮細(xì)胞簇（E2）表達(dá)兩個(gè)最著名的機(jī)械敏感基因 Klf2 和 Klf4 的較高水平，并且這些基因在暴露于擾動(dòng)流的內(nèi)皮細(xì)胞簇中表達(dá)顯著降低,，如 LCA 中的 E8,。擾動(dòng)流誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞 E8 簇中基因的表達(dá)，這些基因在 VSMCs（Acta2 和 Tagln）,、成纖維細(xì)胞（Dcn1）和免疫細(xì)胞（Cd74,、H2-Eb1、H2-Aa 和 H2-Ab1）中也高度表達(dá),，表明內(nèi)皮細(xì)胞在血流紊亂條件下可能發(fā)生EndMT并獲得免疫細(xì)胞樣特征,。通過(guò) Panther 基因本體分析比較穩(wěn)定流暴露的 E2 和擾動(dòng)流暴露的 E8 簇之間的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)擾動(dòng)流誘導(dǎo)許多與促動(dòng)脈粥樣硬化通路相關(guān)的已知生物過(guò)程,，包括炎癥,、EndMT、細(xì)胞凋亡,、血管生成和內(nèi)皮通透性,。偽時(shí)間軌跡分析和其他差異基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性分析證實(shí)，E8 細(xì)胞比 E2 細(xì)胞表達(dá)更高水平的 EndMT（Acta2,、Cnn1,、Snai1 和 Tagln）和 EndIT（C1qa、C1qb,、C5ar1 和 Tnf） 標(biāo)記基因,。此外，體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于擾動(dòng)流誘導(dǎo)了 EndMT 標(biāo)志物（SNAI1 和 TAGLN）和 EndIT 標(biāo)志物（C1QC 和 C5AR1）的表達(dá),，表明擾動(dòng)流可以在沒(méi)有任何其他細(xì)胞類(lèi)型（如免疫細(xì)胞）的情況下誘導(dǎo)培養(yǎng)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞重編程,。這些結(jié)果表明,，紊亂的血流誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇賱?dòng)脈粥樣硬化表型，其特征是炎癥,、EndMT 和 EndIT（即 FIRE）（圖4）,。

圖4     單細(xì)胞 RNA 測(cè)序顯示受擾動(dòng)流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞重編程。

總之,，來(lái)自血流的剪切應(yīng)力有效調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的表型和功能變化,，從而阻止或促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)介導(dǎo)各種機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機(jī)械傳感器轉(zhuǎn)導(dǎo)這些生物力學(xué)線索,，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組變化以及細(xì)胞功能,。高通量組學(xué)結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某霈F(xiàn)揭示了許多調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的血流敏感基因、蛋白質(zhì)和通路,。穩(wěn)定血流誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞表型,，而血流紊亂誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化表型，其特征是內(nèi)皮形態(tài)和屏障功能改變,、內(nèi)皮代謝受損,、氧化還原調(diào)節(jié)、增殖和細(xì)胞凋亡,、炎癥途徑誘導(dǎo)以及轉(zhuǎn)分化為其他細(xì)胞類(lèi)型,，例如 EndMT。此外,，體內(nèi) scRNA-seq 和 scATAC-seq 研究表明,，擾動(dòng)流不僅會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮炎癥和 EndMT，還會(huì)誘導(dǎo) EndIT,，研究人員將其定義為 FIRE（血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞重編程）,。FIRE 在內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化中的機(jī)制和作用是未解之謎，調(diào)節(jié) FIRE 的血流敏感分子可能是新的治療靶點(diǎn),。

參考文獻(xiàn)：Tamargo IA, Baek KI, Kim Y, Park C, Jo H. Flow-induced reprogramming of endothelial cells in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol. 2023 Nov;20(11):738-753. doi: 10.1038/s41569-023-00883-1. Epub 2023 May 24. PMID: 37225873; PMCID: PMC10206587.

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