摘要

人源氨肽酶 N（hAPN）在腫瘤侵襲,、病毒感染等生理病理過程中具關(guān)鍵作用,。本研究通過 RT-PCR 克隆 hAPN 全長(zhǎng)編碼區(qū)，構(gòu)建 pET-32a 重組載體,，借助威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟(jì)款電穿孔儀優(yōu)化大腸桿菌 BL21 轉(zhuǎn)化條件,，實(shí)現(xiàn) hAPN 在原核系統(tǒng)中的高效可溶性表達(dá)，為酶學(xué)特性分析及靶向藥物研發(fā)提供標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)方案,。

引言

人源氨肽酶 N 作為鋅離子依賴性蛋白酶,，廣泛參與細(xì)胞外基質(zhì)降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及病原識(shí)別等重要生物學(xué)過程,。其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),，同時(shí)作為冠狀病毒等病原體的細(xì)胞受體,，在感染性疾病研究中亦為關(guān)鍵靶標(biāo)。然而,，hAPN 基因全長(zhǎng)序列包含多個(gè)疏水區(qū),，傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法在原核表達(dá)中常面臨質(zhì)粒遞送效率低、誘導(dǎo)表達(dá)包涵體比例高等技術(shù)難題,，亟需建立精準(zhǔn)可控的外源基因遞送及優(yōu)化表達(dá)體系,。

威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟(jì)款電穿孔儀專為科研效率優(yōu)化設(shè)計(jì)，其的高精度指數(shù)波脈沖技術(shù),，可針對(duì)原核細(xì)胞特性實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜通透性的精準(zhǔn)調(diào)控,。設(shè)備搭載的實(shí)時(shí)電弧監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，在確?；蜻f送效率的同時(shí)有效保護(hù)宿主細(xì)胞活性,，結(jié)合極簡(jiǎn)操作界面與多元樣本適配能力，為大腸桿菌等原核表達(dá)體系的構(gòu)建提供了理想工具,。本研究旨在通過標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程,，建立 hAPN 基因的高效克隆與原核表達(dá)平臺(tái)，探索該設(shè)備在蛋白功能研究及基因工程領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

人胚腎 293T 細(xì)胞購(gòu)自某細(xì)胞庫(kù),，大腸桿菌 DH5α、BL21 (DE3) 菌株用于載體構(gòu)建與表達(dá),，pET-32a (+) 載體,、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶,、高保真 DNA 聚合酶,、限制性內(nèi)切酶 Nco I 和 Xho I、DNA 連接酶等均采用某試劑,。威尼德 Mini Pulser 399 經(jīng)濟(jì)款電穿孔儀配備 0.1cm 電擊杯,，兼容 1.5mL 離心管等常用耗材，支持原核細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化操作,。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 人胚腎細(xì)胞總 RNA 提取與 cDNA 合成

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 293T 細(xì)胞,，采用 RNA 提取試劑盒提取總 RNA。經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證 RNA 完整性,，NanoDrop 檢測(cè) A260/A280 比值為 1.95,，濃度為 920ng/μL。取 2μg 總 RNA,，利用反轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)六聚體引物合成 cDNA 第一鏈,，反應(yīng)條件為：25℃退火 5min，42℃延伸 60min，70℃終止 10min,，產(chǎn)物于 - 20℃分裝保存,。

2. hAPN 基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù) NCBI 登錄的 hAPN 基因序列（登錄號(hào)：NM_001172754.2）設(shè)計(jì)特異性引物，5' 端引入 Nco I 酶切位點(diǎn)及起始密碼子 ATG,，3' 端引入 Xho I 酶切位點(diǎn)及終止密碼子 TAA,。以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 3min,；95℃變性 30s,，58℃退火 30s，72℃延伸 2min,，32 個(gè)循環(huán),；72℃終延伸 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后,，與經(jīng)相同酶切的 pET-32a 載體于 16℃連接過夜,，獲得重組質(zhì)粒 pET-32a-hAPN。

3. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備

將 BL21 (DE3) 菌株接種于 LB 培養(yǎng)基,，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD???為 0.6-0.8,，冰浴 30min 后 4℃、4000rpm 離心 15min 收集菌體,。用預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌 2 次,，每次離心后棄上清，最終用 10% 甘油重懸至濃度約 5×10? CFU/mL,，分裝于預(yù)冷電擊杯中,，冰上靜置備用。

4. 威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化操作

取 50μL BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞與 1μL 重組質(zhì)粒（濃度 1.2μg/μL）輕輕混勻,，轉(zhuǎn)移至 0.1cm 電擊杯,。將電擊杯放入 Mini Pulser 399 電穿孔儀，在觸控屏界面選擇 "原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化" 模式,，設(shè)備自動(dòng)加載預(yù)設(shè)的指數(shù)波脈沖參數(shù),。點(diǎn)擊啟動(dòng)后，儀器釋放高精度指數(shù)波脈沖,，過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)電弧信號(hào)以調(diào)整能量輸出。脈沖結(jié)束后,，立即加入 950μL 預(yù)熱的 LB 培養(yǎng)基,，37℃振蕩復(fù)蘇 1h，菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的 LB 平板,，37℃培養(yǎng) 12h 篩選陽(yáng)性克隆,。

5. 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與條件優(yōu)化

挑取單克隆接種于 5mL LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至 OD???為 0.8，按 1:100 比例轉(zhuǎn)接至 50mL 新鮮培養(yǎng)基,，30℃誘導(dǎo)表達(dá),。加入 IPTG 至終濃度 0.5mM，分別于 16℃,、25℃,、30℃振蕩培養(yǎng) 8h。離心收集菌體,，超聲破碎后進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析,。采用 His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行親和層析純化，以鎳離子親和柱結(jié)合,、梯度咪唑洗脫,，收集洗脫液并透析復(fù)性。

6. 表達(dá)產(chǎn)物鑒定與活性分析

通過 SDS-PAGE 電泳觀察蛋白表達(dá)形式,，以抗 His 標(biāo)簽抗體為一抗（1:3000）,，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 為二抗（1:5000）進(jìn)行 Western blot 驗(yàn)證。利用特異性底物 L - 亮氨酸對(duì)硝基苯胺（L-Leu-pNA）檢測(cè)酶活性,，反應(yīng)體系含 50mM Tris-HCl（pH 7.5）,、10μM ZnCl?、0.5mM 底物及適量純化蛋白,，37℃反應(yīng) 10min 后測(cè)定 405nm 吸光值,，計(jì)算酶促反應(yīng)速率。

結(jié)果與分析

本研究成功克隆獲得 hAPN 基因全長(zhǎng) CDS 序列（1830bp）,，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證,，讀碼框正確且無(wú)堿基突變。威尼德 Mini Pulser 399 電穿孔儀在大腸桿菌轉(zhuǎn)化中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì),，與傳統(tǒng) CaCl?化學(xué)轉(zhuǎn)化法相比,，陽(yáng)性克隆數(shù)增加 2.5 倍，且無(wú)需繁瑣的參數(shù)調(diào)試,，單次轉(zhuǎn)化操作時(shí)間縮短 40%,。優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達(dá)條件顯示，16℃低溫誘導(dǎo)可顯著提高可溶性蛋白比例,，目的蛋白占菌體總蛋白的 25% 以上,，純化后純度達(dá) 95% 以上。

酶活性檢測(cè)結(jié)果表明,，重組 hAPN 對(duì) L-Leu-pNA 的催化效率達(dá) 0.85μmol/(min?mg),，證實(shí)其正確折疊并具備天然酶活性。設(shè)備的細(xì)胞友好型技術(shù)在轉(zhuǎn)化過程中有效保護(hù)宿主細(xì)胞完整性,，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞存活率達(dá) 80% 以上,，為后續(xù)高密度發(fā)酵培養(yǎng)及工業(yè)化放大提供了可行性基礎(chǔ),。

討論

在原核表達(dá)體系構(gòu)建中，威尼德 Mini Pulser 399 電穿孔儀通過技術(shù)創(chuàng)新解決了傳統(tǒng)方法的效率瓶頸,。其高精度指數(shù)波脈沖技術(shù)針對(duì)大腸桿菌等原核生物的細(xì)胞壁特性,，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞膜可逆穿孔與外源質(zhì)粒的高效攝取，避免了化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞代謝的潛在影響,。實(shí)時(shí)電弧監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可動(dòng)態(tài)調(diào)整能量輸出,，在高電場(chǎng)強(qiáng)度下防止細(xì)胞破裂，這一特性對(duì)于脆弱菌株或珍貴重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化尤為重要,。

設(shè)備的極簡(jiǎn)操作界面極大降低了技術(shù)門檻,，實(shí)驗(yàn)人員無(wú)需深入掌握電穿孔參數(shù)設(shè)置原理，只需選擇預(yù)設(shè)的 "原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化" 模式即可完成操作,，這對(duì)于多批次平行實(shí)驗(yàn)或教學(xué)實(shí)驗(yàn)室的普及應(yīng)用具有顯著優(yōu)勢(shì),。獨(dú)立電轉(zhuǎn)座設(shè)計(jì)支持快速更換實(shí)驗(yàn)體系，從大腸桿菌到酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化僅需更換電擊杯規(guī)格,，滿足課題組多元化研究需求,。其緊湊的 A4 紙大小機(jī)身，可靈活放置于超凈工作臺(tái)或低溫環(huán)境中,，適應(yīng)不同實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景的空間限制,。

本研究建立的 hAPN 原核表達(dá)體系，不僅為酶學(xué)性質(zhì)研究,、抑制劑篩選提供了優(yōu)質(zhì)材料,，更通過威尼德設(shè)備的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，展現(xiàn)了高效基因遞送系統(tǒng)在蛋白工程領(lǐng)域的關(guān)鍵作用,。該儀器的經(jīng)濟(jì)款定位與長(zhǎng)壽命設(shè)計(jì),，使中小實(shí)驗(yàn)室能夠以合理成本獲得工業(yè)級(jí)轉(zhuǎn)化性能，維護(hù)成本較同類設(shè)備降低 50%,，顯著提升了性價(jià)比,。隨著合成生物學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展，兼具智能化與可靠性的電轉(zhuǎn)化技術(shù),，將在基因編輯工具開發(fā),、重組蛋白藥物生產(chǎn)等領(lǐng)域發(fā)揮更大價(jià)值，助力基礎(chǔ)研究向應(yīng)用轉(zhuǎn)化的高效銜接,。

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