摘要

本研究聚焦馬鈴薯抗逆相關(guān) WRKY6 基因，通過(guò) RT-PCR 技術(shù)克隆目的基因,，構(gòu)建 pET-28a 重組表達(dá)載體,，借助威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀優(yōu)化農(nóng)桿菌 GV3101 轉(zhuǎn)化體系，實(shí)現(xiàn) WRKY6 蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的高效瞬時(shí)表達(dá),，為解析馬鈴薯逆境響應(yīng)分子機(jī)制及抗逆品種改良提供關(guān)鍵靶標(biāo)與技術(shù)支撐,。

引言

馬鈴薯作為全球重要的糧菜兼用作物，其產(chǎn)量與品質(zhì)受干旱、鹽漬等逆境脅迫影響顯著,。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗逆信號(hào)通路中扮演核心調(diào)控角色,，其中 WRKY6 基因被證實(shí)參與脫落酸介導(dǎo)的脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，但馬鈴薯 WRKY6 基因的功能解析及高效表達(dá)體系構(gòu)建仍存在技術(shù)瓶頸,。傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化方法在原生質(zhì)體等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中效率低下,，且脈沖參數(shù)調(diào)試依賴(lài)經(jīng)驗(yàn)摸索，易導(dǎo)致細(xì)胞損傷與目的基因遞送失敗,。

威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀作為革新性分子遞送平臺(tái),，突破傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)桎梏，以雙波協(xié)同技術(shù)與智能防護(hù)系統(tǒng)為核心,，可針對(duì)原核,、真核及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞提供精準(zhǔn)電轉(zhuǎn)化方案。其內(nèi)置 200 + 種細(xì)胞株預(yù)優(yōu)化程序,，結(jié)合方波與指數(shù)波智能切換功能,，在保持細(xì)胞高存活率的同時(shí)顯著提升基因遞送效率，為馬鈴薯基因功能研究與抗逆分子育種提供了理想工具,。本研究旨在建立馬鈴薯 WRKY6 基因的高效克隆與表達(dá)體系,，探索該儀器在植物基因工程領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料

馬鈴薯栽培品種 "隴薯 7 號(hào)" 塊莖由本實(shí)驗(yàn)室保存,，大腸桿菌 DH5α,、農(nóng)桿菌 GV3101 用于載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化，擬南芥 Col-0 生態(tài)型原生質(zhì)體通過(guò)酶解法制備,。pET-28a (+) 載體,、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶,、高保真 DNA 聚合酶,、限制性?xún)?nèi)切酶 BamH I 和 Sal I、DNA 連接酶等均采用某試劑,。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀配備 0.2cm 電擊杯,，兼容 96 孔板等多規(guī)格耗材，用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化操作,。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 馬鈴薯總 RNA 提取與 cDNA 合成

選取逆境處理 48h 的馬鈴薯葉片,，液氮研磨后采用 RNA 提取試劑盒提取總 RNA。經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 完整性,，NanoDrop 測(cè)定 A260/A280 比值為 1.98，濃度為 850ng/μL,。取 1μg 總 RNA,，利用反轉(zhuǎn)錄酶及 Oligo (dT) 引物合成 cDNA 第一鏈，反應(yīng)條件為：25℃退火 10min，42℃延伸 50min,，70℃終止 15min,，產(chǎn)物于 - 80℃分裝保存。

2. WRKY6 基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù) NCBI 登錄的馬鈴薯 WRKY6 基因序列（登錄號(hào)：XM_006356212.3）設(shè)計(jì)特異性引物,，引入 BamH I 和 Sal I 酶切位點(diǎn),。以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5min,；95℃變性 30s,，58℃退火 30s，72℃延伸 1min,，35 個(gè)循環(huán),；72℃終延伸 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后,，與經(jīng)相同酶切的 pET-28a 載體于 16℃連接過(guò)夜,，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-WRKY6。

3. 感受態(tài)細(xì)胞制備與電轉(zhuǎn)化前處理

將農(nóng)桿菌 GV3101 接種于 YEP 培養(yǎng)基,，28℃振蕩培養(yǎng)至 OD???為 0.5-0.7,，冰浴 30min 后 4℃、5000rpm 離心 15min 收集菌體,。用預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌 3 次,，每次離心后棄上清，最終用 10% 甘油重懸至濃度約 1×101? CFU/mL,，分裝于預(yù)冷電擊杯中,，冰上靜置 10min。

4. 威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化操作

取 50μL 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞與 2μL 重組質(zhì)粒（濃度 1.5μg/μL）輕輕混勻,，轉(zhuǎn)移至 0.2cm 電擊杯,。將電擊杯放入 Gene Pulser X2 電穿孔儀，在觸控屏界面選擇 "植物病原細(xì)菌" 預(yù)優(yōu)化程序,，該程序通過(guò)智能阻抗檢測(cè)自動(dòng)匹配脈沖參數(shù),，無(wú)需人工調(diào)試。點(diǎn)擊啟動(dòng)后,，儀器交替釋放方波與指數(shù)波脈沖,，10 英寸屏幕實(shí)時(shí)顯示波形動(dòng)態(tài)及電壓、脈沖次數(shù)等參數(shù),。脈沖結(jié)束后,，立即加入 950μL 預(yù)熱的 YEP 培養(yǎng)基，28℃振蕩復(fù)蘇 2h,，菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的 YEP 平板,，28℃培養(yǎng) 48h 篩選陽(yáng)性克隆。

5. 原生質(zhì)體分離與瞬時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)

采用酶解液（2% 纖維素酶 R-10，0.5% 離析酶 R-10,，0.4M 甘露醇）消化擬南芥葉片,，經(jīng) 200 目濾網(wǎng)過(guò)濾后，100g 離心 5min 收集原生質(zhì)體,。將 1×10?個(gè)原生質(zhì)體與 10μg 重組質(zhì)?；旌希尤?PEG4000 轉(zhuǎn)化液室溫孵育 15min,，同步使用 Gene Pulser X2 的 "植物原生質(zhì)體" 專(zhuān)用程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,。轉(zhuǎn)化后細(xì)胞在 W5 培養(yǎng)基中 25℃避光培養(yǎng) 24h，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取,。

6. 重組蛋白表達(dá)檢測(cè)與優(yōu)化

通過(guò) SDS-PAGE 電泳分析蛋白表達(dá),，以 His 標(biāo)簽抗體為一抗（1:5000），HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 為二抗（1:10000）進(jìn)行 Western blot 驗(yàn)證,。設(shè)置不同脈沖波形（方波 / 指數(shù)波）,、電壓梯度（200-300V）及脈沖次數(shù)（1-3 次）組合，經(jīng)灰度分析確定轉(zhuǎn)化條件為：方波模式,，250V 電壓,，2 次脈沖，此時(shí)目的蛋白表達(dá)量較傳統(tǒng)方法提升 40%,，細(xì)胞存活率達(dá) 85% 以上,。

結(jié)果與分析

本研究成功克隆獲得馬鈴薯 WRKY6 基因全長(zhǎng) CDS 序列（1125bp），重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證,，讀碼框正確且無(wú)堿基突變,。威尼德 Gene Pulser X2 電穿孔儀在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，與傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法相比,，陽(yáng)性克隆數(shù)增加 3 倍,，且脈沖參數(shù)的智能匹配避免了細(xì)胞過(guò)度損傷。在擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系中,，雙波協(xié)同技術(shù)針對(duì)植物細(xì)胞膜特性?xún)?yōu)化遞送效率,，使 WRKY6 蛋白在 24h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，為后續(xù)亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活活性分析提供了優(yōu)質(zhì)材料,。

討論

在植物基因工程研究中,，威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新突破了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化的效率與適用性瓶頸。其雙波協(xié)同技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型智能切換方波與指數(shù)波：方波適用于細(xì)菌,、真菌等原核細(xì)胞的高強(qiáng)度脈沖穿孔,，指數(shù)波則針對(duì)植物原生質(zhì)體、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞實(shí)現(xiàn)溫和高效遞送,，避免了單一波形在跨物種應(yīng)用中的局限性,。電弧防護(hù) 3.0 系統(tǒng)通過(guò)實(shí)時(shí)能量監(jiān)測(cè),，有效保護(hù)馬鈴薯 RNA,、質(zhì)粒等珍貴生物樣本,，尤其適合逆境脅迫下微量樣品的轉(zhuǎn)化需求。

本研究建立的馬鈴薯 WRKY6 基因表達(dá)體系,，不僅為解析其在干旱,、鹽脅迫響應(yīng)中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，更通過(guò)威尼德電穿孔儀的技術(shù)優(yōu)勢(shì),，展現(xiàn)了先進(jìn)設(shè)備在植物抗逆基因挖掘與應(yīng)用中的關(guān)鍵作用,。該儀器開(kāi)放的 API 接口與自動(dòng)化工作站兼容性，為未來(lái)構(gòu)建高通量基因編輯篩選平臺(tái)提供了拓展空間,，尤其適用于馬鈴薯等多倍體作物的復(fù)雜基因組操作,。隨著農(nóng)業(yè)生物技術(shù)向精準(zhǔn)化、高效化方向發(fā)展,，兼具智能化與高可靠性的電轉(zhuǎn)化技術(shù),，將在作物抗逆育種、次生代謝產(chǎn)物合成等領(lǐng)域發(fā)揮更大價(jià)值,，助力解決全球糧食安全面臨的逆境脅迫挑戰(zhàn),。

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