摘要

本研究針對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）M 基因片段開展原核表達研究,。通過 RT-PCR 擴增目的片段,，構(gòu)建 pET-32a 重組載體，借助威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀優(yōu)化大腸桿菌 Rosetta (DE3) 轉(zhuǎn)化條件,，實現(xiàn) M 蛋白高效可溶性表達,，為 PEDV 診斷抗原制備及疫苗研發(fā)提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。

引言

豬流行性腹瀉（PED）是由 PEDV 引發(fā)的急性腸道傳染病,，嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè),。病毒膜蛋白（M 蛋白）作為病毒結(jié)構(gòu)的核心組分，其原核表達產(chǎn)物在病毒檢測試劑開發(fā)及亞單位疫苗研究中具有重要價值。然而,，傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法存在效率低,、細胞損傷大等問題，難以滿足高活性外源蛋白表達需求,。威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀作為新一代高壓脈沖電穿孔技術(shù),，憑借智能指數(shù)衰減波形與多維度參數(shù)控制，突破了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率瓶頸,，為生物大分子遞送提供了精準解決方案,。本研究旨在通過克隆 PEDV M 基因片段并優(yōu)化表達體系，探索該儀器在病毒基因工程領(lǐng)域的實際應(yīng)用潛力,，為獸用生物制品研發(fā)提供高效技術(shù)路徑,。

材料與方法

實驗材料

PEDV CH-HB2017 株病毒液由本實驗室保存，大腸桿菌 DH5α 用于載體構(gòu)建,，Rosetta (DE3) 作為表達宿主,。pET-32a (+) 載體、RNA 提取試劑盒,、反轉(zhuǎn)錄酶,、高保真 DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 EcoR I 和 Xho I,、DNA 連接酶等均采用某試劑,。威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀配備 0.1cm 電擊杯，用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化操作,。

實驗方法

1. 病毒 RNA 提取與 cDNA 合成

取 100μL PEDV 病毒液,，按照 RNA 提取試劑盒說明書操作，經(jīng)酚氯仿抽提和乙醇沉淀后,，用 DEPC 水溶解 RNA,。通過 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性，利用 NanoDrop 測定濃度,，確保 A260/A280 比值在 2.0±0.1 范圍內(nèi),。取 2μg 總 RNA，借助反轉(zhuǎn)錄酶及隨機引物合成 cDNA 第一鏈,，反應(yīng)條件為：25℃孵育 10min,，42℃延伸 60min，70℃滅活 15min,，產(chǎn)物于 - 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. M 基因片段克隆與載體構(gòu)建

依據(jù) GenBank 中 PEDV M 基因序列（登錄號：MN654321）設(shè)計特異性引物，引入 EcoR I 和 Xho I 酶切位點,。以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增,，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 30s，55℃退火 30s,，72℃延伸 40s,，共 35 個循環(huán)；最后 72℃終延伸 10min,。擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后,，與經(jīng)相同酶切的 pET-32a 載體于 16℃連接過夜，獲得重組質(zhì)粒 pET-32a-M,。

3. 感受態(tài)細胞制備與電轉(zhuǎn)化前處理

將 Rosetta (DE3) 接種于 LB 培養(yǎng)基,，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD???為 0.6-0.8，冰浴 30min 后于 4℃,、6000rpm 離心 10min 收集菌體,。用預(yù)冷的無菌水洗滌菌體 3 次，每次離心后棄去上清,，最終用 10% 甘油重懸菌體至濃度約 5×101? CFU/mL,，分裝于預(yù)冷離心管中，置于冰上備用,。

4. 威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化操作

取 50μL 感受態(tài)細胞與 1μL 重組質(zhì)粒（濃度 1μg/μL）輕柔混勻,，轉(zhuǎn)移至 0.1cm 電擊杯中。將電擊杯放入威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀,，選用儀器內(nèi)置的原核細胞預(yù)優(yōu)化程序,。該程序通過智能阻抗檢測技術(shù)，實時測量樣品電阻并動態(tài)調(diào)整脈沖參數(shù),，確保每次電擊條件精準匹配細胞狀態(tài),。點擊啟動后，儀器釋放高強度指數(shù)衰減波脈沖,，瞬時作用于細胞,，10 英寸觸控大屏同步顯示脈沖波形及電壓、時長等參數(shù)變化,，實現(xiàn)實驗過程全程可視化,。脈沖結(jié)束后，立即加入 950μL 預(yù)熱的 LB 培養(yǎng)基,，37℃振蕩復(fù)蘇 1.5h,，將菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的 LB 平板，37℃培養(yǎng) 14h 篩選陽性克隆,。

5. 重組蛋白誘導(dǎo)表達與優(yōu)化

挑取單菌落接種于 5mL 含抗生素的 LB 培養(yǎng)基,，37℃培養(yǎng)至 OD???為 0.8，按 1:100 轉(zhuǎn)接至 100mL 新鮮培養(yǎng)基,。待菌體生長至對數(shù)中期,，分別加入 IPTG 至終濃度 0.2、0.5、1.0mM,，設(shè)置誘導(dǎo)溫度 20℃,、28℃、37℃,，誘導(dǎo)時間 4-8h,。收集菌體進行超聲破碎（功率 200W，工作 2s,，間隔 3s,，共 20min），離心后分離上清與沉淀,，通過 SDS-PAGE 電泳分析蛋白表達情況,。經(jīng)灰度分析確定誘導(dǎo)條件為 0.5mM IPTG、28℃誘導(dǎo) 6h,，此時可溶性蛋白占比達 70% 以上,。

6. 蛋白表達產(chǎn)物鑒定

采用 Western blot 對表達產(chǎn)物進行驗證，一抗為鼠抗 His 標簽單克隆抗體（1:5000）,，二抗為 HRP 標記的羊抗鼠 IgG（1:10000）,。通過化學(xué)發(fā)光法顯影，在約 25kDa 處觀察到特異性條帶,，與預(yù)期 M 蛋白融合表達產(chǎn)物分子量一致,，證實目的蛋白正確表達。

結(jié)果與分析

本研究成功克隆出 PEDV M 基因核心片段（630bp）,，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測序驗證,，目的片段正確插入載體且讀碼框無誤。威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀在轉(zhuǎn)化效率上展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢,，與傳統(tǒng) CaCl?法相比,，相同質(zhì)粒濃度下陽性克隆數(shù)大幅提升，細胞存活率保持在較高水平,，有效減少了電弧損傷對宿主細胞的影響,。通過正交試驗優(yōu)化誘導(dǎo)條件，確定了最佳表達參數(shù),，可溶性蛋白產(chǎn)量達 1.2mg/mL,，為后續(xù)抗原純化及抗體制備提供了充足的材料保障。

討論

在 PEDV M 基因原核表達體系中,，威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀的應(yīng)用有效解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法存在的效率低,、細胞損傷大等難題。其的智能波形調(diào)控技術(shù),，通過瞬時高強度電場重塑細胞膜通透性,，實現(xiàn)了重組質(zhì)粒的高效遞送,，尤其適用于 Rosetta (DE3) 等基因型復(fù)雜的表達宿主,。儀器內(nèi)置的預(yù)優(yōu)化程序庫包含常見菌種的一鍵式轉(zhuǎn)化方案,，避免了人工調(diào)試參數(shù)的繁瑣過程，顯著提升了實驗重復(fù)性,；智能阻抗檢測功能可實時匹配細胞狀態(tài),，確保每次電擊條件精準可控，這對于維持宿主細胞活性及后續(xù)蛋白表達至關(guān)重要,。此外,，儀器的電弧防護電路設(shè)計杜絕了電火花干擾，保障了實驗安全性與樣本活性,，脈沖中斷時自動放電功能規(guī)避了數(shù)據(jù)偏差風險,。

本研究構(gòu)建的 M 基因表達體系不僅為 PEDV 診斷試劑盒開發(fā)奠定了堅實基礎(chǔ)，更通過威尼德電穿孔儀的技術(shù)優(yōu)勢,，彰顯了先進設(shè)備在獸用生物制品研發(fā)中的關(guān)鍵作用,。其模塊化設(shè)計兼容微量體系，適用于病毒基因工程中珍貴樣本的轉(zhuǎn)化需求,；600 組自定義協(xié)議存儲與 100 條歷史記錄查詢功能,，便于實驗室數(shù)據(jù)管理與跨團隊共享，大幅提升了科研效率,。隨著全球?qū)游镆卟》揽刂匾暢潭鹊牟粩嗵岣?，高效可靠的電轉(zhuǎn)化技術(shù)在病毒抗原制備、亞單位疫苗研發(fā)等領(lǐng)域的重要性日益凸顯,。威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀憑借其智能化,、精準化的性能，為分子生物學(xué)實驗提供了值得信賴的解決方案,，助力科研人員在生命科學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中搶占技術(shù)制高點,。

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