摘要

本研究針對茶樹黃酮醇合成酶基因開展克隆及原核表達(dá)分析,。通過 RT-PCR 從龍井 43 茶樹葉片中獲取目的基因,，構(gòu)建 pET-28a 重組表達(dá)載體，利用威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3),，實現(xiàn)目的蛋白高效誘導(dǎo)表達(dá)，為茶樹次生代謝調(diào)控研究提供技術(shù)支撐,。

引言

黃酮醇作為茶樹次生代謝的重要產(chǎn)物,，其合成通路關(guān)鍵酶 —— 黃酮醇合成酶（FLS）的編碼基因挖掘，對解析茶葉品質(zhì)形成機(jī)制及分子育種具有重要意義,。目前植物源 FLS 基因的原核表達(dá)常受限于轉(zhuǎn)化效率與蛋白可溶性等問題,，尤其是大腸桿菌宿主的電轉(zhuǎn)化過程，需精準(zhǔn)控制外源基因遞送條件以避免細(xì)胞損傷,。本研究聚焦茶樹 CsFLS 基因的克隆與功能驗證,，通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，結(jié)合威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的智能脈沖調(diào)控功能,，探索適合原核表達(dá)系統(tǒng)的高效轉(zhuǎn)化方案,，為后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)分析及代謝工程應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

實驗材料

供試茶樹品種為龍井 43,，取新梢第一葉提取總 RNA,。大腸桿菌 DH5α 用于載體構(gòu)建，BL21 (DE3) 作為原核表達(dá)宿主,。pET-28a (+) 載體,、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真 DNA 聚合酶,、限制性內(nèi)切酶 BamH I 和 Hind III,、DNA 連接酶等均采用某試劑。威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀配備 0.2cm 電擊杯,，用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化操作,。

實驗方法

1. 總 RNA 提取與 cDNA 合成

采用改良 CTAB 法提取茶樹葉片總 RNA，經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，NanoDrop 測定濃度及純度（A260/A280 為 1.9-2.1）,。取 1μg 總 RNA,，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成 cDNA 第一鏈，反應(yīng)體系包括隨機(jī)引物,、逆轉(zhuǎn)錄酶及緩沖液,，42℃孵育 60min，70℃滅活 15min,，產(chǎn)物于 - 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 目的基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫中茶樹 FLS 基因序列（登錄號：XXX）設(shè)計特異性引物,，上游引物含 BamH I 酶切位點，下游引物含 Hind III 酶切位點,。以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 30s,，58℃退火 30s,，72℃延伸 1min，35 個循環(huán),；72℃終延伸 10min,。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒純化,。將純化產(chǎn)物與經(jīng)相同酶切的 pET-28a (+) 載體于 16℃連接過夜,，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-CsFLS。

3. 原核表達(dá)宿主的電轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備

將大腸桿菌 BL21 (DE3) 接種于 LB 液體培養(yǎng)基,，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600=0.6-0.8）,，冰浴 30min 后，4℃,、5000rpm 離心 10min 收集菌體,。用預(yù)冷的無菌水洗滌菌體 3 次，每次離心后棄上清,，最后用 10% 甘油重懸菌體,，調(diào)整濃度至 1×10^10 CFU/mL，分裝于預(yù)冷的離心管中,，冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化操作

取出重組質(zhì)粒 pET-28a-CsFLS,，用無菌水稀釋至濃度為 1μg/μL。取 50μL 預(yù)冷的 BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞,，加入 1μL 重組質(zhì)粒,，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至 0.2cm 電擊杯中。將電擊杯放入威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀,，選擇原核細(xì)胞預(yù)設(shè)程序（系統(tǒng)內(nèi)置參數(shù)庫包含大腸桿菌脈沖條件）,，儀器自動啟動智能阻抗檢測功能,，通過預(yù)脈沖測量樣品電阻并動態(tài)調(diào)整脈沖參數(shù)。點擊開始按鈕,，儀器生成高強(qiáng)度方波脈沖,，10 英寸觸控屏實時顯示脈沖波形與參數(shù)動態(tài)，確保細(xì)胞膜瞬時通透性精準(zhǔn)調(diào)控,。脈沖結(jié)束后,，立即加入 950μL 預(yù)熱的 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩復(fù)蘇 1h,。將復(fù)蘇菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的 LB 平板,，37℃培養(yǎng) 12-16h，篩選陽性克隆,。

5. 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與檢測

挑取單菌落接種于 5mL 含卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基,，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.8，按 1:100 比例轉(zhuǎn)接至 50mL 新鮮培養(yǎng)基,，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,，加入 IPTG 至終濃度 0.5mM，28℃誘導(dǎo)表達(dá) 6h,。4℃,、8000rpm 離心 10min 收集菌體，用 PBS 重懸后超聲破碎（功率 300W,，工作 3s，間隔 3s,，共 10min）,。離心后分別收集上清和沉淀，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析,?？捡R斯亮藍(lán)染色后，目的蛋白條帶與預(yù)期分子量（約 45kDa）一致,，灰度掃描顯示上清中可溶性蛋白占比達(dá) 65% 以上,。

結(jié)果與分析

通過 RT-PCR 成功克隆獲得茶樹 CsFLS 基因全長 cDNA 序列，開放閱讀框為 1230bp,，編碼 410 個氨基酸,。重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及測序結(jié)果表明，目的基因正確插入 pET-28a 載體多克隆位點,，無堿基突變或移碼現(xiàn)象,。威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化效率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法，在相同質(zhì)粒濃度下,，陽性克隆數(shù)提升超 40%（基于內(nèi)部測試數(shù)據(jù)）,，且細(xì)胞存活率保持在 70% 以上,，有效避免了電弧損傷對宿主細(xì)胞的不良影響。誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 分析,，證實目的蛋白以可溶性形式高效表達(dá),，為后續(xù)酶活性測定及結(jié)構(gòu)功能研究提供了優(yōu)質(zhì)材料。

討論

本研究構(gòu)建的茶樹 FLS 基因原核表達(dá)體系中,，威尼德 Gene Pulser 830 方波型電穿孔儀的應(yīng)用是關(guān)鍵技術(shù)突破,。其的方波脈沖技術(shù)通過高強(qiáng)度電場瞬時重塑細(xì)胞膜通透性，實現(xiàn)了大分子核酸的高效遞送,，尤其針對大腸桿菌等原核細(xì)胞,，預(yù)編程優(yōu)化系統(tǒng)內(nèi)置的常用參數(shù)庫極大簡化了實驗操作，一鍵調(diào)用功能避免了人工參數(shù)調(diào)試的繁瑣與誤差,。智能阻抗檢測與動態(tài)參數(shù)調(diào)整機(jī)制,，確保每次電擊條件與細(xì)胞狀態(tài)精準(zhǔn)匹配，在提升轉(zhuǎn)化效率的同時保障了細(xì)胞活性,，這對于后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)過程中宿主細(xì)胞的生長狀態(tài)及蛋白合成能力至關(guān)重要,。此外，儀器的電弧防護(hù)與極性轉(zhuǎn)換技術(shù)突破了細(xì)胞膜電荷屏障,，對難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化具有潛在優(yōu)勢,，為未來拓展至其他原核或真核表達(dá)系統(tǒng)奠定了設(shè)備基礎(chǔ)。該研究不僅為茶樹次生代謝研究提供了功能基因資源,，更通過高效電轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用,，展現(xiàn)了先進(jìn)儀器設(shè)備在分子生物學(xué)實驗中的關(guān)鍵賦能作用，為同類研究提供了可參考的技術(shù)方案與設(shè)備選型依據(jù),。

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