合成肽的生產(chǎn)涉及多個(gè)步驟,，包括脫保護(hù)、活化、偶聯(lián)和從固相支持體上切割最終序列,。雜質(zhì)，例如因過(guò)早鏈終止或缺失氨基酸產(chǎn)生的雜質(zhì),，會(huì)影響最終產(chǎn)品的安全性和有效性,，因此，必須通過(guò)液相色譜分析分離這些雜質(zhì),。在液相分析中,，選擇合適的流動(dòng)相和色譜柱對(duì)于各組分實(shí)現(xiàn)最佳分離至關(guān)重要。

采用島津LCMS-2050單桿質(zhì)譜儀,，進(jìn)行多種流動(dòng)相,、多柱的篩選，搭配LabSolutions MD軟件,，有效提升合成肽相關(guān)雜質(zhì)方法開(kāi)發(fā)的效率,。

此次研究基于一種肽和五種具有不同序列的有關(guān)雜質(zhì)作為合成肽的模型樣品(表1)。制備全長(zhǎng)肽(FLP:B-促黑素),、較短長(zhǎng)度產(chǎn)物的 p.A1del,、p.A1_E2del、p.A1_K3del 和 p.A1,、D5del的缺失序列以及 Met(O2)(FLP 中的甲硫氨酸被氧化成甲硫氨酸砜)作為樣品,。

色譜柱

Shim-pack Scepter C18-120

(1.9μm,3.0x100mm)

Shim-pack GISS C18

(1.9μm,3.0x100mm）

Shim-pack Velox SP-C18

(1.8μm,3.0x100mm)

Shim-pack Scepter C8

(1.9μm,3.0x100mm)

Shim-pack Scepter Phenyl

(1.9μm,3.0x100mm)

Shim-pack GIST HP C18-AQ

(1.9μm,3.0x100mm)

柱溫：40℃

樣品溶劑：水

流動(dòng)相：

A：

Line A：0.1%三fu乙酸水溶液

Line B：0.1%甲酸水溶液

Line C：10mmol/L甲酸銨（pH=4）水溶液

Line D：10mmol/L乙酸銨（pH=5）水溶液

B：

Line A：乙腈

Line B：甲醇

流速：0.5mL/min

洗脫梯度：10%B（0min）→60%B（10 min）→10%B(10.01min-15min）

紫外檢測(cè)器：220 nm

質(zhì)譜系統(tǒng)：LCMS-2050

對(duì)比流動(dòng)相和色譜柱的篩選結(jié)果,，水相流動(dòng)相和有機(jī)相流動(dòng)相的組成對(duì) FLP 及相關(guān)雜質(zhì)的分離有顯著影響?；贚abSolutions MD軟件計(jì)算評(píng)估值,，如表2所示。從中選擇的分析條件進(jìn)行進(jìn)一步方法優(yōu)化,。

進(jìn)一步優(yōu)化柱溫,，考察篩選出評(píng)估值最高的3個(gè)檢測(cè)條件下，柱溫對(duì)于分離的影響,。使用 Scepter C8-120 色譜柱,，采用 0.1%甲酸和甲醇的流動(dòng)相，p.A1del和 FLP 之間的分離度更好,。

80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(0.1%甲酸/甲醇/ScepterC8-120)

80℃(① ),70℃(②),60℃(③),50℃℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸銨 /乙腈:甲醇=50:50 /Velox SP-C18)

80℃(①),70℃(②),60℃(③),50℃(④),40℃(⑤)(10mmol/L醋酸銨 /甲醇/Scepter C8-120)