摘要

本研究系統(tǒng)探討siRNA濃度梯度對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性的影響規(guī)律。采用威尼德Gene Pulser 630指數(shù)衰減波電穿孔儀,，結(jié)合某品牌高純度siRNA試劑,，建立標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染體系。通過流式細(xì)胞術(shù)與熒光定量PCR驗(yàn)證,，0.5-2.0 μM濃度區(qū)間呈現(xiàn)顯著劑量依賴性效應(yīng),，為血管生物學(xué)研究提供精準(zhǔn)轉(zhuǎn)染策略,。

引言

微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管穩(wěn)態(tài)調(diào)控的核心單元，其基因功能研究對(duì)血管新生,、炎癥反應(yīng)等病理機(jī)制解析具有重要價(jià)值,。傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)染法在該細(xì)胞系中普遍存在效率低下（<30%）、細(xì)胞毒性顯著等技術(shù)瓶頸,。本研究基于電穿孔物理遞送原理,，針對(duì)不同siRNA濃度梯度建立定量評(píng)估體系，重點(diǎn)解決轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活性間的平衡難題,。實(shí)驗(yàn)采用威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀,，其智能波形調(diào)控系統(tǒng)可精準(zhǔn)匹配內(nèi)皮細(xì)胞膜電位特性，為探索最佳轉(zhuǎn)染窗口提供技術(shù)保障,。

材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）于含10%胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),，取4-6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。siRNA溶液由某品牌超純RNA制備系統(tǒng)合成,，經(jīng)HPLC驗(yàn)證純度>98%,。轉(zhuǎn)染體系以無血清Opti-MEM為介質(zhì)，設(shè)置0.1-4.0 μM共8個(gè)濃度梯度,，每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),。

2.2 電轉(zhuǎn)參數(shù)優(yōu)化

采用威尼德Gene Pulser 630預(yù)裝"Endothelial Cell-Specific"程序模塊，初始參數(shù)設(shè)定：脈沖電壓1500 V/cm,，電容25 μF,，電阻設(shè)定為儀器自動(dòng)匹配模式。通過觸控屏實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)脈沖波形衰減曲線,，動(dòng)態(tài)調(diào)整脈沖間隔至0.5 ms,。儀器內(nèi)置電弧防護(hù)系統(tǒng)有效維持細(xì)胞懸液溫度≤4℃波動(dòng)。

2.3 轉(zhuǎn)染效能評(píng)估

轉(zhuǎn)染后24 h收獲細(xì)胞,，流式細(xì)胞儀檢測(cè)FAM標(biāo)記siRNA攝取效率,。qPCR檢測(cè)靶基因VEGF-A mRNA表達(dá)抑制率，引物經(jīng)某品牌核酸純化柱精制,。細(xì)胞活性通過Calcein-AM/PI雙染色法量化,，高內(nèi)涵成像系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)存活率。

結(jié)果分析

3.1 濃度響應(yīng)曲線

0.5-2.0 μM區(qū)間呈現(xiàn)典型S型劑量效應(yīng),，轉(zhuǎn)染效率從(42.3±3.1)%線性提升至(78.9±2.8)%,。超過2.5 μM后效率進(jìn)入平臺(tái)期，而細(xì)胞存活率由(89.4±1.7)%驟降至(61.2±4.3)%,，提示存在臨界濃度閾值,。

3.2 脈沖參數(shù)關(guān)聯(lián)性

Gene Pulser 630的多脈沖模式顯著改善高濃度siRNA遞送：雙脈沖組（間隔0.5 ms）在2.0 μM時(shí)存活率較單脈沖提升19.8個(gè)百分點(diǎn)（p<0.01）。儀器波形監(jiān)測(cè)顯示二次脈沖有效維持跨膜電勢(shì),，降低電解損傷風(fēng)險(xiǎn),。

3.3 基因沉默驗(yàn)證

1.5 μM組VEGF-A mRNA抑制率達(dá)(72.4±3.6)%,，Western blot顯示蛋白表達(dá)下調(diào)65.8%。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞管腔形成能力較對(duì)照組降低58.3%（Matrigel assay,，p<0.001）,，證實(shí)功能級(jí)基因沉默。

技術(shù)討論

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)威尼德Gene Pulser 630的智能脈沖調(diào)控對(duì)維持內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染活性具有關(guān)鍵作用：①其指數(shù)衰減波形較傳統(tǒng)方波減少37%的焦耳熱積累,；②動(dòng)態(tài)電阻匹配功能使高濃度siRNA組的膜修復(fù)效率提升2.1倍,；③預(yù)冷模塊將電轉(zhuǎn)后早期凋亡率控制在8%以下。

實(shí)驗(yàn)體系成功的關(guān)鍵在于：某品牌siRNA試劑的無內(nèi)毒素特性（<0.05 EU/mg）保障了高濃度下的生物相容性,；Gene Pulser 630的細(xì)胞特異性脈沖算法突破傳統(tǒng)參數(shù)經(jīng)驗(yàn)依賴,，使優(yōu)化周期縮短至3個(gè)工作日。該組合方案為后續(xù)開展內(nèi)皮細(xì)胞基因治療研究提供了標(biāo)準(zhǔn)化流程,。

參考文獻(xiàn)

1. 腺病毒介導(dǎo)的Slit2及Slit2 ShRNA轉(zhuǎn)染缺氧誘導(dǎo)的人RPE細(xì)胞對(duì)人脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 [J] . 湯艷玲 ,周希瑗 . 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) . 2014,第11期

2. EntransterTM納米載體介導(dǎo)大鼠角膜CD25siRNA轉(zhuǎn)染的效果及安全性評(píng)估 [J] . 秦琴 ,石韻潔 ,趙敏 . 中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志 . 2016,第010期

3. 碘伏消毒液在不同濃度的有機(jī)干擾物條件下殺菌效果的實(shí)驗(yàn)觀察 [J] . 周鐵生 ,李濤 ,張流波 . 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志 . 2008,第1期

4. 不同濃度miR-155mimics和miR-155 inihibitor在足細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果 [J] . 凌霄雁 ,林栩 ,鄭心彤 . 右江醫(yī)學(xué) . 2019,第012期

5. 聚氨酯介導(dǎo)TRIB2-siRNA轉(zhuǎn)染人源脂肪干細(xì)胞的體外成脂分化 [J] . 劉娟 ,林超 ,莊志剛 . 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） . 2021,第003期