脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）在保護(hù)mRNA并促進(jìn)其進(jìn)入靶細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)合成方面表現(xiàn)出色。然而,，細(xì)胞攝取LNPs后,，mRNA的翻譯效率不僅取決于LNPs的遞送效率，還受到細(xì)胞內(nèi)必需代謝物（如代謝能量源,、輔酶和氨基酸）可用性的影響,。本研究提出了一種代謝物共遞送策略，通過(guò)將關(guān)鍵代謝物封裝在mRNA LNPs中,，以提高mRNA的翻譯效率,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與不含代謝物的LNPs相比,，共遞送ATP和GTP的LNPs在體外和體內(nèi)均顯著提高了mRNA編碼蛋白的表達(dá)水平,，尤其在缺氧條件下效果更為顯著。這一策略為改善mRNA LNP療法提供了新的思路,。
結(jié)果與討論
本研究選擇了四類(lèi)關(guān)鍵代謝物進(jìn)行共遞送,，包括核苷酸/核苷酸衍生物（ATP、GTP,、ADP,、AMP、焦磷酸）,、氨基酸（L-His）,、輔酶（NAD、FAD,、NADH）和碳水化合物（葡萄糖）,。通過(guò)微流體混合技術(shù)制備了包含這些代謝物的LNPs，并對(duì)其進(jìn)行了表征,。結(jié)果顯示,，LNPs的粒徑在157-187 nm之間，多分散性指數(shù)（PDI）在0.14-0.26之間,，表面電荷（ζ電位）在-3.5-1.5 mV之間,，這些參數(shù)與不含代謝物的LNPs相似，表明代謝物的加入并未顯著影響LNPs的物理性質(zhì),。此外,，mRNA的封裝效率在63.0-90.0%之間，各代謝物的封裝效率在5.0-68.9%之間,，表明代謝物被成功封裝在LNPs中,。螢火蟲(chóng)熒光素酶（FLuc）表達(dá)：在常氧（21%氧氣）和缺氧（1%氧氣）條件下，評(píng)估了不同代謝物共遞送的LNPs對(duì)FLuc表達(dá)的影響,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,，在常氧條件下,，共遞送GTP和ATP的LNPs顯著提高了FLuc的表達(dá)水平，分別比不含代謝物的LNPs提高了約9倍和8倍（圖2b）,。相比之下,，共遞送氨基酸、輔酶和碳水化合物的LNPs對(duì)FLuc表達(dá)水平的提升不顯著（圖2b）,。在缺氧條件下,，共遞送GTP和ATP的LNPs仍然顯著提高了FLuc的表達(dá)水平，分別比不含代謝物的LNPs提高了約19倍和16倍（圖2c）,。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)：通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察,，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP和ATP的LNPs在常氧和缺氧條件下均顯著提高了EGFP的表達(dá)水平。在常氧條件下,，與不含代謝物的LNPs相比,，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)（圖2d）。在缺氧條件下,，這一趨勢(shì)同樣明顯（圖2e）,。人促紅細(xì)胞生成素（EPO）表達(dá)：通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）評(píng)估，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP和ATP的LNPs在常氧和缺氧條件下均顯著提高了EPO的表達(dá)水平,。在常氧條件下，與不含代謝物的LNPs相比,，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞上清液中EPO的濃度分別提高了約3倍和2.5倍（圖2f）,。在缺氧條件下，這一提升效果更為顯著,，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞上清液中EPO的濃度分別提高了約4倍和3.5倍（圖2g）,。
1.3 機(jī)制研究結(jié)果：
細(xì)胞黏附與攝取：通過(guò)流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡觀察,，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP和ATP的LNPs顯著增加了細(xì)胞黏附與攝取,。與不含代謝物的LNPs相比，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞顯示出更高的幾何平均熒光強(qiáng)度（GMFI）,，表明更多的LNPs被細(xì)胞攝?。▓D3a, b）。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn),，共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞內(nèi)紅色熒光信號(hào)（代表Cy5標(biāo)記的FLuc mRNA）更強(qiáng)（圖3c, d）,。內(nèi)吞機(jī)制：通過(guò)使用特定的內(nèi)吞抑制劑（EIPA、NaN?和細(xì)胞松弛素D）,，探究了不同LNPs的內(nèi)吞途徑,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共遞送GTP和ATP的LNPs主要通過(guò)能量依賴(lài)的內(nèi)吞途徑被細(xì)胞攝?。▓D3e-g）,。這一發(fā)現(xiàn)為理解我們的代謝物共遞送策略如何影響LNPs的細(xì)胞攝取提供了重要線索,。內(nèi)涵體逃逸：通過(guò)共聚焦顯微鏡和Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）分析，評(píng)估了不同LNPs的內(nèi)涵體逃逸特性,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,，共遞送GTP和ATP的LNPs在內(nèi)涵體逃逸方面表現(xiàn)出更好的特性，PCC值顯著低于不含代謝物的LNPs（圖4c）,。此外,，通過(guò)鈣黃綠素泄漏實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP和ATP的LNPs處理后的細(xì)胞中鈣黃綠素信號(hào)更廣泛地分布于細(xì)胞質(zhì)中,，進(jìn)一步證實(shí)了其更好的內(nèi)涵體逃逸特性（圖4d）,。
1.4 體內(nèi)療效與耐受性評(píng)估結(jié)果：
體內(nèi)FLuc表達(dá)：在雌性C57BL/6小鼠中通過(guò)尾靜脈注射評(píng)估不同LNPs的體內(nèi)療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,，共遞送GTP和ATP的LNPs顯著提高了FLuc在肝臟和脾臟中的表達(dá)水平（圖5a, b）,。特別是ATP共遞送的LNPs，其FLuc信號(hào)強(qiáng)度顯著高于不含代謝物的LNPs（圖5b）,。此外,，代謝物共遞送策略并未改變LNPs的天然生物分布特性（圖5c）。體內(nèi)EPO表達(dá)：通過(guò)ELISA評(píng)估血清中EPO的濃度,，發(fā)現(xiàn)共遞送GTP,、ATP和AMP的LNPs顯著提高了EPO的表達(dá)水平（圖5d）。這一結(jié)果表明,，代謝物共遞送策略在體內(nèi)同樣能夠有效提高mRNA編碼蛋白的表達(dá)水平,。耐受性評(píng)估：通過(guò)組織學(xué)評(píng)估、血液檢測(cè)和體重保留研究,，發(fā)現(xiàn)代謝物共遞送策略在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的耐受性,。組織學(xué)評(píng)估結(jié)果顯示，共遞送代謝物的LNPs處理后的小鼠主要器官（肝臟,、脾臟和肺）未出現(xiàn)明顯的組織損傷或炎癥反應(yīng)（圖5e）,。血液檢測(cè)結(jié)果顯示，共遞送代謝物的LNPs處理后的小鼠血液生化指標(biāo)（如堿性磷酸酶,、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶,、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、血尿素氮和肌酐）與PBS對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖5f）,。此外,，體重保留研究結(jié)果顯示，共遞送代謝物的LNPs處理后的小鼠體重與PBS對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖S9）,。這些結(jié)果表明,，代謝物共遞送策略在體內(nèi)是安全且可耐受的。結(jié)論
本研究提出了一種代謝物共遞送策略,，通過(guò)將關(guān)鍵代謝物封裝在mRNA LNPs中,，顯著提高了mRNA的翻譯效率,。共遞送ATP和GTP的LNPs在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，尤其在缺氧條件下效果更為顯著,。此外,，這些LNPs還顯示出良好的耐受性。未來(lái)研究將進(jìn)一步探討ATP和GTP如何改善LNP的遞送效率,，并評(píng)估該策略在其他疾病模型中的應(yīng)用潛力,。
參考文獻(xiàn)：Ma, Yutian, et al. "A Metabolite Co-Delivery Strategy to Improve mRNA Lipid Nanoparticle Delivery." ACS Applied Materials & Interfaces (2025).
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