1、測(cè)試細(xì)胞類(lèi)型
在選擇儀器之前,,我們首先要思考兩個(gè)問(wèn)題:
1,、自己的細(xì)胞房培養(yǎng)哪些細(xì)胞?
一般實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞房培養(yǎng)的大多為常規(guī)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系,,比如腫瘤細(xì)胞,、動(dòng)物哺乳細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等,,這類(lèi)細(xì)胞直徑范圍在5-40μm,。
還有一些可能是從組織或血液分離的原代細(xì)胞,比如脾細(xì)胞,、PBMC細(xì)胞,、臍帶血或骨髓源的原代間充質(zhì)干細(xì)胞等;這類(lèi)細(xì)胞組分復(fù)雜,,可能有組織碎片、血小板,、紅細(xì)胞等雜質(zhì)干擾 ,。
最后呢,還有一些老師在某些細(xì)分領(lǐng)域計(jì)數(shù)需求,,比如酵母細(xì)胞(2-6μm),、T細(xì)胞(6-10μm)球藻細(xì)胞,、芽孢桿菌等微生物小粒徑細(xì)胞(1-10μm),甚至低于1μm 的大腸桿菌 ,。
我們根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞類(lèi)型的直徑大小,,第一步要確認(rèn)合適的物鏡放大倍數(shù),就跟在顯微鏡下有4X,、10X,、40X和100X不同放大倍數(shù)一樣,需要選擇一個(gè)正確的物鏡來(lái)滿(mǎn)足成像清晰和識(shí)別,。正常的細(xì)胞系和原代細(xì)胞計(jì)數(shù)儀采用5X物鏡光學(xué)放大就可滿(mǎn)足,,針對(duì)酵母和球藻以及一些粒徑更小的微生物樣本,需要用到10X甚至20X物鏡才能夠看的清晰,。
2,、細(xì)胞分析是關(guān)注細(xì)胞活率還只是細(xì)胞濃度?
細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分為明場(chǎng)款(激發(fā)光為白光)和熒光款(不同顏色的激發(fā)光),,其中明場(chǎng)包括非臺(tái)盼藍(lán)染色和臺(tái)盼藍(lán)染色,,如果您平時(shí)只關(guān)注細(xì)胞濃度,這時(shí)選一款明場(chǎng)計(jì)數(shù)儀即可滿(mǎn)足需求,。那如果細(xì)胞濃度和細(xì)胞活率都關(guān)注,,我們就需要考慮用經(jīng)典臺(tái)盼藍(lán)染色還是AO(吖啶橙)/PI(碘化丙啶)雙熒光染色分析。
臺(tái)盼藍(lán)和熒光染色比較
臺(tái)盼藍(lán)染色 | AO/PI熒光染色 | |
原理 | 細(xì)胞膜的通透性 (非特異性染色) | 核酸染色 (特異性染色) |
識(shí)別區(qū)分 | 活細(xì)胞:不染色 死細(xì)胞:藍(lán)色 | 活細(xì)胞:綠熒光 死細(xì)胞:紅熒光 |
適用范圍 | 常規(guī)傳代培養(yǎng)細(xì)胞 | 細(xì)胞系,、原代細(xì)胞,、免疫細(xì)胞等 |
當(dāng)然,除了臺(tái)盼藍(lán)和AO/PI雙熒光染色之外,,還可以通過(guò)AO/DAPI染色,,DAPI染色可以標(biāo)記所有細(xì)胞核,可能在特定條件下染色死細(xì)胞,。PI相比DAPI染死細(xì)胞則更為專(zhuān)一,,用于標(biāo)記失去膜完整性的死細(xì)胞。針對(duì)細(xì)菌的活率分析,,還可以通過(guò)SYTO-9/PI染色,,SYTO-9是一種能夠透過(guò)細(xì)胞膜的綠色熒光核酸染料,可用于細(xì)菌的RNA和DNA染色,。
2,、測(cè)試數(shù)據(jù)的可靠性
在完成第一步選擇后,接下來(lái)需要選擇一個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)可靠的計(jì)數(shù)儀,,無(wú)論它功能多么強(qiáng)大,,數(shù)據(jù)可靠性是關(guān)鍵的,它主要體現(xiàn)在測(cè)試數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,。
其中準(zhǔn)確性是測(cè)試值與真實(shí)值之間的差異,,我們一方面可以通過(guò)與人工血球計(jì)數(shù)對(duì)比,,相同的一管細(xì)胞樣本,通常要求計(jì)數(shù)儀與人工之間的計(jì)數(shù)誤差在10%以?xún)?nèi),;另一方面可以用標(biāo)準(zhǔn)品(不同濃度,、直徑和活率的標(biāo)準(zhǔn)品)進(jìn)行驗(yàn)證;要求更高的用戶(hù)會(huì)請(qǐng)第三方計(jì)量公司進(jìn)行再次計(jì)量驗(yàn)證,,最后結(jié)合自己的細(xì)胞進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,,通過(guò)以上多重驗(yàn)證,最后確定儀器的準(zhǔn)確性 ,。
其次,,穩(wěn)定性通常我們可以對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行幾組平行測(cè)試,或者對(duì)同一個(gè)高濃度樣品做梯度稀釋分析線性關(guān)系,,這里面有一個(gè)重要的參數(shù)CV值(變異系數(shù)),,一個(gè)可靠的計(jì)數(shù)儀,在合適的濃度范圍內(nèi),,通常CV值<5%,。

決定一個(gè)計(jì)數(shù)儀數(shù)據(jù)可靠性,主要有以下兩個(gè)方面:
硬件 包括光路系統(tǒng),、成像系統(tǒng),,其中成像的像素決定圖片的清晰度,從而影響到識(shí)別結(jié)果,;配置越高,,成像越清晰;其次是自動(dòng)化過(guò)程,,這里面包括進(jìn)樣,、對(duì)焦、曝光等參數(shù),,全自動(dòng)過(guò)程能減少人為操作帶來(lái)的誤差,,從而提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性,
軟件算法 在獲得一張高質(zhì)量圖片之后,,要對(duì)其進(jìn)行算法識(shí)別分析,,目前主要基于兩種算法,一種是基于灰度值(普通算法),,另外一種是基于深度學(xué)習(xí)人工智能算法(AI算法),,這種先進(jìn)算法相對(duì)于普通算法,能夠?qū)蹐F(tuán)細(xì)胞精準(zhǔn)分割,,對(duì)不規(guī)則細(xì)胞精準(zhǔn)識(shí)別,,對(duì)含有細(xì)胞碎片、雜質(zhì)等復(fù)雜樣本精確計(jì)數(shù),這種算法能夠?qū)崿F(xiàn)不同領(lǐng)域,、不用應(yīng)用場(chǎng)景的計(jì)數(shù)分析。萌薇生物也是國(guó)內(nèi)早期將AI技術(shù)應(yīng)用在細(xì)胞計(jì)數(shù)領(lǐng)域并進(jìn)行儀器開(kāi)發(fā)的廠家,。
3,、檢測(cè)效率
傳統(tǒng)的血球計(jì)數(shù)法能夠不斷被智能細(xì)胞計(jì)數(shù)儀替代,其中檢測(cè)效率是一個(gè)非常大的因素,,如果您每天檢測(cè)的細(xì)胞樣本量多,,檢測(cè)效率相當(dāng)關(guān)鍵,一個(gè)優(yōu)秀的計(jì)數(shù)儀,,不僅準(zhǔn)和穩(wěn),,快也很重要。檢測(cè)效率主要包括以下兩點(diǎn):
單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間:通常檢測(cè)一個(gè)樣品,,人工計(jì)數(shù)時(shí)間在3-5分鐘,,計(jì)數(shù)儀在10秒到2分鐘時(shí)間不等,產(chǎn)生差異的原因主要是儀器的自動(dòng)化程度,,尤其是手動(dòng)進(jìn)樣和手動(dòng)調(diào)焦會(huì)直接影響到計(jì)數(shù)的效率,,其次是算法分析的時(shí)間也有差異,例如先進(jìn)的AI算法將直接縮短處理圖片的時(shí)間,,這也是為什么萌薇計(jì)數(shù)儀實(shí)現(xiàn)測(cè)試分析速度快的重要原因,。
計(jì)數(shù)板通量:一塊血球計(jì)數(shù)板有兩個(gè)加樣孔槽,市面上絕大數(shù)計(jì)數(shù)儀也是采用兩個(gè)通量,,當(dāng)我們樣本量比較多時(shí),,就需要更高通量的計(jì)數(shù)板,一次性可以同時(shí)測(cè)多少樣品,,這也是決定效率的一個(gè)因素,。
4、其他因素
除了以上三點(diǎn)以外,,還有一些其他因素也得考慮:
機(jī)型--分體機(jī)還是一體機(jī),,主要根據(jù)細(xì)胞房空間大小來(lái)選擇,分體機(jī)需要連接電腦,,一體機(jī)則包含顯示屏,,可直接操作,相對(duì)分體機(jī)價(jià)格要高一些,,但使用起來(lái)簡(jiǎn)單方便,。
軟件分析功能--一臺(tái)優(yōu)秀的計(jì)數(shù)儀在完成基本的參數(shù)(細(xì)胞濃度、活率,、直徑,、圓度、聚團(tuán)率)分析功能之后,還要具備對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)的整理和分析,,包括直徑分布圖,、測(cè)試數(shù)據(jù)再分析、數(shù)據(jù)對(duì)比分析(CV值計(jì)算),、增殖曲線等分析功能,;滿(mǎn)足JPG、EXCEL,、PDF等多種格式的數(shù)據(jù)輸出方式,,不僅能通過(guò)U盤(pán)輸出還可以通過(guò)服務(wù)器輸出;數(shù)據(jù)的備份和恢復(fù)也是必要的,,保障用戶(hù)的數(shù)據(jù),;除此之外,稀釋計(jì)算器和傳代計(jì)算器會(huì)讓您的實(shí)驗(yàn)變得更加簡(jiǎn)單,。
性?xún)r(jià)比--硬件配置高,,軟件分析功能強(qiáng)大,技術(shù)參數(shù)優(yōu)秀的計(jì)數(shù)儀往往相比于低配置的參數(shù)價(jià)格高一些,,但不能一味追求低價(jià),,讓數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和精確性沒(méi)了保障,甚至反而影響我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度,,最后可能面臨重新選擇,。所有小薇經(jīng)常在一些用戶(hù)細(xì)胞房會(huì)發(fā)現(xiàn)在吃灰的低端計(jì)數(shù)儀,面對(duì)這些價(jià)格低的儀器選擇要慎重,!
服務(wù)--這里包括售前售后服務(wù),、試用培訓(xùn)、技術(shù)支持,,3Q驗(yàn)證服務(wù),,以及儀器的質(zhì)保期。
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