一、凍存原理：對(duì)抗低溫?fù)p傷的三大機(jī)制?

1. ?冷凍保護(hù)劑：細(xì)胞的“生命盾-牌”?

作用機(jī)理?

DMSO（二甲基亞砜）或甘油作為滲透性保護(hù)劑,，穿透細(xì)胞膜后：

降低細(xì)胞內(nèi)水分冰點(diǎn),，抑制冰晶形成

與水分子形成氫鍵，延緩結(jié)晶速率

穩(wěn)定膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu),，防止低溫破裂

濃度選擇?

常規(guī)使用5%-10%濃度,，高濃度（如20%）可能引發(fā)毒性，需平衡保護(hù)效果與細(xì)胞損傷,。

2. ?程序降溫：精準(zhǔn)控制冰晶生長(zhǎng)?

相變危險(xiǎn)區(qū)?（-15℃至-60℃）：此階段冰晶最易形成,，需以?1℃/min?速率緩慢降溫，避免大冰晶刺穿細(xì)胞器,。

玻璃化冷凍?：超快速降溫（>1000℃/min）使細(xì)胞內(nèi)外形成無定形玻璃態(tài),，需搭配高濃度保護(hù)劑（如30% DMSO+蔗糖）。

3. ?低溫儲(chǔ)存：代謝暫停的關(guān)鍵?

-80℃?：短期保存（6-12個(gè)月）,，細(xì)胞內(nèi)仍存微量代謝活動(dòng),。

液氮（-196℃）?：長(zhǎng)期保存（數(shù)十年），細(xì)胞進(jìn)入完-全休眠狀態(tài),。

二,、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（附避坑指南）?

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備?

材料清單?

凍存液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%血清+10% DMSO）

程序降溫盒（或異丙醇梯度盒）

凍存管（標(biāo)記耐低溫標(biāo)簽）

離心機(jī)、倒置顯微鏡

細(xì)胞預(yù)處理?

凍存前24小時(shí)換液,，確保細(xì)胞處于?對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期?（貼壁細(xì)胞融合度80%-90%）

支原體檢測(cè)陰性（避免污染整個(gè)細(xì)胞庫(kù)）

(1) 細(xì)胞消化與收集?

棄培養(yǎng)基,，PBS輕柔沖洗2次（去除血清抑制酶活性）

加入0.25%胰酶（含EDTA）消化,，37℃孵育?2-5分鐘?（鏡下觀察細(xì)胞間隙擴(kuò)大后立即終止）

加入含血清培養(yǎng)基中和酶，吹打成單細(xì)胞懸液

離心條件?：1000rpm × 5分鐘,，去上清（殘留胰酶會(huì)損傷細(xì)胞）

(2)凍存液配制?

黃金配比?：70%基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 20%血清 + 10% DMSO

避坑要點(diǎn)?：

 DMSO需預(yù)冷至4℃,，現(xiàn)配現(xiàn)用（防止降解產(chǎn)生毒性）

采用?梯度混合法?：先混合培養(yǎng)基與血清，逐滴加入DMSO,，避免滲透壓劇烈變化

(3)分裝與標(biāo)記?

細(xì)胞密度?：貼壁細(xì)胞1×10? ~ 5×10?/mL,，懸浮細(xì)胞加倍

分裝量?：1-1.5mL/管，預(yù)留1/4空間防凍裂

標(biāo)識(shí)規(guī)范?：

細(xì)胞名稱,、代次,、凍存日期（如Hela-p53+/+_P15_20231001）

使用耐低溫記號(hào)筆或激光雕刻（普通標(biāo)簽易脫落）

(4)程序降溫?

常規(guī)程序?：

① 4℃預(yù)冷15分鐘

② 程序降溫盒轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜（降溫速率約1℃/min）

③ 24小時(shí)內(nèi)移入液氮?dú)庀啵?150℃至-196℃）

無程序盒替代方案?：

將凍存管包裹棉花，置于泡沫盒中-80℃過夜,，但存活率可能下降10%-20%

 三,、凍存成敗的5大關(guān)鍵指標(biāo)?

 四、常見問題與解決方案?

 復(fù)蘇后細(xì)胞大量死亡?

可能原因：DMSO毒性（暴露超30分鐘）,、降溫速率不當(dāng)

對(duì)策：解凍后立即離心換液,，檢查程序盒降溫曲線

凍存管破裂?

預(yù)防：分裝量不超過凍存管容積3/4，使用厚壁凍存管

液氮罐污染?

處理：每月用10%過氧乙酸熏蒸罐體,，凍存管密封前酒精擦拭