一,、試劑盒的組成與工作原理

試劑盒的組成

活/死細(xì)胞雙染色試劑盒主要包含兩種關(guān)鍵熒光染料：用于標(biāo)記活細(xì)胞的綠色熒光染料和用于標(biāo)記死細(xì)胞的紅色熒光染料,。這兩種染料具有不同的化學(xué)特性和作用機(jī)制,，能夠分別與活細(xì)胞和死細(xì)胞中的特定成分結(jié)合,，從而實現(xiàn)對細(xì)胞生死狀態(tài)的區(qū)分,。

工作原理

綠色熒光染料（如 Calcein-AM）能夠自由穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜,，并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶轉(zhuǎn)化為具有熒光的 Calcein，從而發(fā)出明亮的綠色熒光,。這一特性使得綠色熒光染料成為標(biāo)記活細(xì)胞的理想選擇,。活細(xì)胞的膜完整性良好,，能夠有效地攝取并保留綠色熒光染料,，而死細(xì)胞由于細(xì)胞膜的破損，無法有效攝取或保留該染料,。

紅色熒光染料（如 PI）則主要用于標(biāo)記死細(xì)胞,。PI 是一種核酸染料，能夠與細(xì)胞內(nèi)的 DNA 結(jié)合并發(fā)出紅色熒光,。在活細(xì)胞中,，細(xì)胞膜的完整性阻止 PI 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),；而在死細(xì)胞中，細(xì)胞膜的破損使得 PI 能夠自由進(jìn)入并與 DNA 結(jié)合,，從而發(fā)出紅色熒光,。

二、操作使用方法

染色前準(zhǔn)備

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：根據(jù)實驗需求,，將細(xì)胞培養(yǎng)至適宜的密度,。對于貼壁細(xì)胞，可使用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞,；對于懸浮細(xì)胞,，直接收集即可。用PBS 洗滌細(xì)胞兩次,，去除培養(yǎng)基和其他雜質(zhì),。

2. 細(xì)胞計數(shù)與調(diào)整濃度：對收集到的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并用適當(dāng)?shù)木彌_液調(diào)整細(xì)胞濃度,，一般建議的細(xì)胞濃度范圍為

   $1 \times 10^5 - 1 \times 10^6 \, \text{cells/mL}$

   ,，以確保在后續(xù)的染色和檢測過程中能夠獲得理想的信號強度和細(xì)胞分布。

染色過程

1. 取適量細(xì)胞懸液：取適量的細(xì)胞懸液（通常為 100 μL）,，加入到新的離心管或培養(yǎng)皿中,。

2. 加入染色試劑：按照試劑盒說明書的要求，分別加入適量的綠色熒光染料和紅色熒光染料,。一般情況下,，每 100 μL 細(xì)胞懸液中需加入數(shù)微升的每種染料，具體用量應(yīng)根據(jù)試劑盒的推薦進(jìn)行調(diào)整,。

3. 輕輕混勻：輕輕吹打或漩渦混勻細(xì)胞懸液,，確保染料均勻分布并充分接觸細(xì)胞。這一步驟對于保證染色的均勻性和準(zhǔn)確性至關(guān)重要,。

4. 避光孵育：將染色后的細(xì)胞懸液置于適當(dāng)?shù)臏囟龋ㄈ?37℃）下避光孵育一段時間,，通常為 15 - 30 分鐘。避光孵育有助于防止染料的光漂白,，確保熒光信號的穩(wěn)定和清晰,。

染色后處理

1. 去除未結(jié)合的染料：用預(yù)冷的 PBS 或其他適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞一次，以去除未結(jié)合的染料,。離心速度為 300×g,，離心時間為 5 分鐘。用適量的緩沖液重新懸浮細(xì)胞,，以減少背景熒光并提高檢測的準(zhǔn)確性,。

2. 分析檢測：將染色后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞儀檢測管或熒光顯微鏡載玻片上，立即進(jìn)行檢測。在流式細(xì)胞儀中,，綠色熒光的激發(fā)波長一般為 488 - 500 nm,，發(fā)射波長為 510 - 530 nm；紅色熒光的激發(fā)波長一般為 490 - 540 nm,，發(fā)射波長為 600 - 630 nm,。

三、質(zhì)量控制與注意事項

質(zhì)量控制

活/死細(xì)胞雙染色試劑盒應(yīng)保存在 4℃左右的低溫環(huán)境中,，避免光照直射和溫度波動過大,。在保存過程中，注意密封保存,，防止試劑揮發(fā)或吸收水分,。試劑盒在有效期內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，每一批次都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測,，確保其性能符合要求,。

注意事項

在實驗過程中，需嚴(yán)格遵循無菌操作規(guī)范,，避免細(xì)胞受到污染,。使用的試劑、培養(yǎng)容器和操作工具都應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌處理,。實驗操作應(yīng)在超凈工作臺中進(jìn)行，以降低污染風(fēng)險,。

染色時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和實驗需求進(jìn)行優(yōu)化,。過短的染色時間可能導(dǎo)致染色不充分，影響檢測結(jié)果,；過長的染色時間則可能導(dǎo)致非特異性染色,，增加背景信號。建議在正式實驗前進(jìn)行小規(guī)模的預(yù)實驗,，以確定最佳的染色條件,。

這兩種熒光染料對光敏感，操作過程中應(yīng)盡量減少樣本的光照時間,，以防止熒光淬滅,。在染色和檢測過程中，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)谋芄獯胧?，如使用避光罩或在暗室中操作,。?xì)胞狀態(tài)監(jiān)測：實驗全程觀察細(xì)胞狀態(tài)，確保良好生理狀態(tài),，異常時及時調(diào)整條件,。