關(guān)鍵詞：游離藥物濃度,，F(xiàn)ree Concentration,，生物樣本前處理，生物樣品前處理,，平衡透析法，equilibrium dialysis（ED）,，超濾法,，Ultra-filtration（UF），快速平衡透析裝置,，RED,，血漿蛋白結(jié)合,，Plasma Protein Binding(PPB)

游離藥物濃度（Free Concentration）是指生物樣本（如血漿、血清,、組織液等）中未與蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)合的游離態(tài)藥物、激素,、代謝物或其他小分子分析物的濃度,。由于許多生物活性物質(zhì)在體內(nèi)會(huì)與蛋白質(zhì)（如白蛋白,、α?-酸性糖蛋白,、免疫球蛋白等）結(jié)合,，只有游離部分才能發(fā)揮藥理或生理活性,，因此測(cè)定游離藥物濃度（Free Concentration）在藥代動(dòng)力學(xué)（PK）、藥效學(xué)（PD）,、臨床監(jiān)測(cè)和生物分析樣本前處理過(guò)程中具有重要意義。

一,、游離濃度的前處理技術(shù)

在生物樣本（如血液,、尿液,、組織等）中測(cè)定游離（未結(jié)合）藥物,、激素或其他分析物的濃度時(shí),，生物樣本前處理步驟需確保目標(biāo)物質(zhì)的游離狀態(tài)不被破壞，同時(shí)去除干擾物質(zhì),。目前的游離藥物濃度分析生物樣品前處理技術(shù)有平衡透析法（equilibrium dialysis,，ED）、超濾法（Ultra-filtration,，UF）,、超速離心法（Ultracentrifugation，UC）,、凝膠過(guò)濾/尺寸排阻色譜（Size-Exclusion Chromatography, SEC）,、固相萃取或免疫親和純化和化學(xué)或酶解處理（結(jié)合型釋放后檢測(cè)）,，但常用的是平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）,、超濾法（Ultra-filtration,，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation，UC）,，其中平衡透析法更是游離藥物濃度生物樣品前處理技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn),。

1.1 平衡透析法

平衡透析法（equilibrium dialysis,，ED）是測(cè)定生物樣本（如血漿,、血清）中游離藥物,、激素或代謝物濃度的金標(biāo)準(zhǔn)方法,，常用于血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)（Plasma Protein Binding, PPB），其核心原理是利用半透膜使游離小分子在樣本與緩沖液之間達(dá)到平衡,，而大分子結(jié)合物（如蛋白結(jié)合型藥物）因無(wú)法透過(guò)膜被分離,。

【試驗(yàn)步驟】

1,、樣本準(zhǔn)備：血漿、血清,、腦脊液或其它基質(zhì)

2、透析裝置：不銹鋼特氟龍板平衡透析裝置（HTD）或快速平衡透析裝置（RED）

3,、膜選擇：纖維素膜

4,、加樣：供體室加入含藥基質(zhì),，受體室加入PBS

5,、孵育：37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~24小時(shí)，根據(jù)裝置決定孵育時(shí)間

6,、終止與收集：分別從供體室和受體室取一定體積的溶液,，用LC-MS/MS、HPLC或免疫分析法檢測(cè)濃度,。

由上可知,，平衡透析法的關(guān)鍵步驟在于裝置、膜的選擇,、平衡時(shí)間的優(yōu)化等三個(gè)方面,。IPHASE作為體外研究生物試劑的引-領(lǐng)者，為提供更好的服務(wù),，開(kāi)發(fā)了普通平衡透析裝置（HTD）和快速平衡透析裝置（RED）兩種,，均配以纖維素膜，以期滿足不同客戶的多種需求,。它們?cè)谠砩舷嗨?，但在?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作效率,、適用性等方面存在差異，以下為兩者詳細(xì)對(duì)比：

簡(jiǎn)而言之,，平衡透析法具有高準(zhǔn)確性,、適用于低結(jié)合率物質(zhì)（游離濃度＜1%）、無(wú)剪切力干擾及可同時(shí)處理多個(gè)樣本（具有96孔板）等多個(gè)優(yōu)點(diǎn),，但其也同時(shí)具備耗時(shí)長(zhǎng),、樣本需求量大、可能受膜吸附或體積位移影響及緩沖液成分可能影響蛋白結(jié)合等多個(gè)缺點(diǎn),。因此,，客戶需根據(jù)具體試驗(yàn)結(jié)合選擇。

1.2 超濾法

超濾法（Ultrafiltration, UF）的核心原理是通過(guò)離心力驅(qū)動(dòng)小分子游離分析物通過(guò)超濾膜,，而大分子蛋白及結(jié)合物被截留,。以下是超濾法的全面解析，包括原理,、步驟,、優(yōu)缺點(diǎn)、優(yōu)化策略及與平衡透析的對(duì)比,。

【試驗(yàn)步驟】

1,、樣本類型：血漿或血清

2、樣本預(yù)處理：3000×g, 10分鐘,，去除細(xì)胞碎片或纖維蛋白

3,、加樣：將100-200 μL血漿加入超濾離心管

4、離心：37℃ 2000-3000×g, 30分鐘（需優(yōu)化轉(zhuǎn)速和時(shí)間,，避免膜堵塞或結(jié)合物解離）

5,、收集濾液：取濾液（通常10-50 μL）用于檢測(cè)（LC-MS/MS、HPLC等）

作為快速經(jīng)濟(jì)測(cè)定游離濃度的方法之一,，超濾法具有快速高效,、使用樣本量少、及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),，但同樣由于其裝置的影響,，超濾法存在著膜吸附、剪切力干擾及高結(jié)合藥物靈敏度受限等不可忽視的缺點(diǎn),。因此,，客戶可根據(jù)自己的試驗(yàn)需求選擇前處理技術(shù)，若需快速篩查或樣本量有限,，可優(yōu)先選擇超濾法,；若需高精度數(shù)據(jù)，則應(yīng)選擇平衡透析法,。

1.3 超速離心法

超速離心法(Ultracentrifugation, UC)是一種基于物理分離的技術(shù),，通過(guò)極-高的離心力（通常 >100,000×g）將生物樣本中的游離分析物與結(jié)合型分析物（如蛋白結(jié)合物）分離。該方法適用于血漿,、血清,、腦脊液等樣本中游離藥物、激素或代謝物的測(cè)定,。其原理是依據(jù)在超高速離心條件下，由于分子大小和密度的差異,，大分子（如蛋白質(zhì)、蛋白結(jié)合型分析物）因分子量大,、密度高而沉降到管底,，而游離的小分子（未結(jié)合）則保留在上清液中。

【試驗(yàn)步驟】

1,、樣本類型：血清,、血漿、組織樣本

2,、離心速度：100,000–150,000×g,，速度過(guò)低可能導(dǎo)致結(jié)合物沉降不完-全

3、離心時(shí)間：30min-2小時(shí),，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致游離分子吸附或降解

4,、溫度：4℃（推薦）或室溫，低溫減少蛋白變性和結(jié)合物解離

5,、離心管類型：聚碳酸酯或超離心專用管,，避免使用易吸附分析物的材質(zhì)

6、收集濾液：小心吸取上清液（避免擾動(dòng)沉淀）,，用于后續(xù)分析（如HPLC,、LC-MS/MS）；

若需測(cè)定結(jié)合型分析物,，可溶解沉淀（如用緩沖液或有機(jī)溶劑）后檢測(cè),。

超速離心法(Ultracentrifugation, UC)由于其不引入抗體、吸附劑等物質(zhì),，具有無(wú)外源干擾,、適用性強(qiáng)和樣本兼容性強(qiáng)等3種優(yōu)點(diǎn)，但由于其通過(guò)高速離心進(jìn)行分離,，亦存在潛在結(jié)合物解離,、樣本損傷多及硬件設(shè)施不滿足試驗(yàn)等問(wèn)題。因此，若實(shí)驗(yàn)條件允許,，可結(jié)合超濾或平衡透析進(jìn)行方法驗(yàn)證,，確保數(shù)據(jù)可靠性。

綜上所述,，常見(jiàn)的游離濃度樣本分析前處理技術(shù)包括平衡透析法（equilibrium dialysis,，ED）、超濾法（Ultra-filtration,，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation,，UC），它們有各自的適用范圍和優(yōu)缺點(diǎn),。因此,，客戶應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況以選擇合適的方法進(jìn)行游離濃度的獲取。

二,、IPHASE產(chǎn)品

綜上所述，游離濃度的生物樣本分析前處理主要有平衡透析法,、超濾法和超速離心法等三種方法,，作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，IPHASE可以給平衡透析前處理提供血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置,、一次性快速平衡透析板,、可重復(fù)使用快速平衡透析板、快速平衡透析插件,、平衡透析膜,、血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置封口膜、血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置底座,、特氟龍板和超濾管等多類產(chǎn)品,。

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匯智和源,，致力于為創(chuàng)新藥研發(fā)企業(yè)及生命科學(xué)研究機(jī)構(gòu)提供高品質(zhì)的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌,，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”,。