實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物，通過實時監(jiān)測每個PCR循環(huán)中的熒光信號變化,，實現(xiàn)對起始模板量的定量分析的技術(shù),。這項技術(shù)由美國Applied Biosystems公司在1995年推出，標(biāo)志著PCR技術(shù)從定性分析到定量分析的飛躍,。

實時熒光定量PCR（qPCR）的基本原理包括三個主要階段,，這些階段反映了PCR擴增過程中的熒光信號變化：

1、基線期：在PCR反應(yīng)開始時,，熒光信號幾乎不變,，主要是因為背景熒光的存在掩蓋了PCR產(chǎn)物的熒光信號,。這一階段的熒光信號變化不大,，接近一條直線，用于設(shè)置基線,。

2,、指數(shù)期：隨著PCR循環(huán)的進行，目標(biāo)DNA序列被指數(shù)級擴增,，熒光信號隨之增加,。這一階段熒光信號呈指數(shù)增長，PCR產(chǎn)物量與起始模板量呈線性關(guān)系,，是進行定量分析的理想階段,。

3、平臺期：當(dāng)PCR反應(yīng)接近完成時,，由于DNA聚合酶活性下降,、底物耗盡或抑制物積累，擴增效率降低，熒光信號的增加趨于平緩,，最終停止,。這一階段熒光信號不再顯著增加，PCR產(chǎn)物達到飽和狀態(tài),。

在指數(shù)期,，通過設(shè)定熒光閾值（閾值循環(huán)數(shù)，Ct值）,，可以準(zhǔn)確地對樣品中的初始模板量進行定量分析,。Ct值越小，說明初始模板量越大,。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線,，可以將Ct值轉(zhuǎn)換為模板的起始拷貝數(shù)，實現(xiàn)對目標(biāo)序列的定量檢測,。

實時熒光定量PCR技術(shù)中有幾個重要的概念,，包括擴增曲線、基線,、熒光閾值和域值循環(huán)數(shù),。
1、擴增曲線（amplification curve）: 是在實時熒光定量PCR中監(jiān)測到的熒光信號隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線,。在進行PCR反應(yīng)過程中,，通過檢測系統(tǒng)對PCR管內(nèi)的樣品進行實時檢測，最后將熒光信號值通過成像技術(shù)顯現(xiàn)在計算機上,。正常的擴增曲線包括四個階段：基線期,、指數(shù)增長期、線性增長期,、平臺期,。
2、基線（baseline）：是背景曲線的一段,，在擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里熒光信號變化不大,，接近一條直線。
3,、熒光閾值（threshold）:是在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個熒光強度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)）,。熒光閾值可以設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期。
4,、閾值循環(huán)數(shù):表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,，即起始拷貝數(shù)越多,，CT值越小;起始拷貝數(shù)越少,CT值越大,。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo),CT值為縱坐標(biāo)的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該模板的起始拷貝數(shù),。