在細(xì)胞生物學(xué)研究中，對細(xì)胞膜進(jìn)行熒光標(biāo)記和示蹤是觀察細(xì)胞行為,、分析細(xì)胞相互作用以及研究細(xì)胞遷移和分布的重要手段,。DiO (DiOC18(3))作為一種綠色熒光的親脂性膜染料，憑借其染色機制和優(yōu)異的性能,，成為細(xì)胞膜標(biāo)記領(lǐng)域的理想選擇,。

一、DiO 的染色機制與特性

DiO 是一種親脂性羰花青染料,，其在水溶液中熒光較弱,，但當(dāng)嵌入細(xì)胞膜后，其熒光強度顯著增強,，同時光穩(wěn)定性也得到顯著提升,。這種熒光增強效應(yīng)歸因于 DiO 分子與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的相互作用。DiO 分子具有疏水性,，能夠自發(fā)地插入到細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中,，并沿著膜平面進(jìn)行側(cè)向擴散。隨著 DiO 分子在細(xì)胞膜中的逐漸擴散,，整個細(xì)胞膜會被均勻染色,，發(fā)出明亮的綠色熒光。

DiO 的熒光信號穩(wěn)定,，不易受到光漂白的影響,，這使得它在長時間的觀察和檢測中表現(xiàn)出色。此外,，DiO 對細(xì)胞的毒性極低,，通常不會影響細(xì)胞的正常生理功能和生存力，適用于活細(xì)胞的長期示蹤和觀察,。

二,、DiO 的應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞膜標(biāo)記

DiO 最常見的應(yīng)用是對細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，以觀察細(xì)胞的形態(tài)和行為,。在細(xì)胞標(biāo)記實驗中,，將細(xì)胞與 DiO 染色液混合孵育，DiO 分子會迅速插入到細(xì)胞膜中并發(fā)出熒光,。通過熒光顯微鏡可以清晰地觀察到細(xì)胞膜的輪廓和形態(tài)變化,。

DiO 標(biāo)記的細(xì)胞膜熒光信號均勻且穩(wěn)定，能夠長時間保持熒光強度,，適用于多種細(xì)胞類型,，包括貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞,。標(biāo)記后的細(xì)胞可以用于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞遷移實驗和細(xì)胞相互作用研究等,。

細(xì)胞示蹤

DiO 被廣泛用于細(xì)胞示蹤實驗,，特別是在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。它可以作為正向或逆向的示蹤劑,，用于標(biāo)記和追蹤神經(jīng)元及其突起,。在神經(jīng)組織切片或活體動物模型中，DiO 標(biāo)記的神經(jīng)元可以通過熒光成像技術(shù)進(jìn)行長期觀察,，揭示神經(jīng)元的連接模式,、信號傳導(dǎo)路徑以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化。

此外,，DiO 還可以用于標(biāo)記和追蹤其他類型的細(xì)胞,，如免疫細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等,。在體內(nèi)實驗中，DiO 標(biāo)記的細(xì)胞可以通過熒光成像技術(shù)實時觀察其在生物體內(nèi)的分布,、遷移和存活情況,，為細(xì)胞治療、組織工程和腫瘤轉(zhuǎn)移等研究提供重要數(shù)據(jù)支持,。

三,、DiO 的操作使用方法

染色前準(zhǔn)備

在進(jìn)行 DiO 染色之前，需要準(zhǔn)備好細(xì)胞樣本,。對于貼壁細(xì)胞,，可以使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞,，去除殘留的培養(yǎng)基成分,。對于懸浮細(xì)胞，直接收集細(xì)胞并進(jìn)行洗滌,。將細(xì)胞調(diào)整到合適的濃度,，一般為 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續(xù)的染色和檢測,。

染色過程

將準(zhǔn)備好的細(xì)胞與 DiO 染色液混合,，DiO 的常用工作濃度為 5 - 20 μM。將混合后的細(xì)胞懸液置于 37℃,、5% CO? 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 5 - 30 分鐘,。在孵育過程中，DiO 分子會插入到細(xì)胞膜中,，產(chǎn)生綠色熒光,。孵育時間可根據(jù)細(xì)胞類型和實驗需求進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的染色效果。

染色后處理

孵育完成后,，用 PBS 輕輕洗滌細(xì)胞兩次,，去除未結(jié)合的染料。對于需要進(jìn)行細(xì)胞膜標(biāo)記觀察的樣本,，將標(biāo)記后的細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中,，加入適量的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),。對于需要進(jìn)行細(xì)胞示蹤實驗的樣本,，將標(biāo)記后的細(xì)胞用于后續(xù)的體內(nèi)或體外實驗。使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察時,，設(shè)置 488 nm 的激發(fā)波長和 500 - 550 nm 的發(fā)射波長檢測通道,，收集綠色熒光信號，實現(xiàn)對細(xì)胞膜的標(biāo)記和示蹤,。

四,、DiO 的優(yōu)勢與注意事項

優(yōu)勢

• 低細(xì)胞毒性：DiO 對細(xì)胞的毒性極低，不會顯著影響細(xì)胞的正常生理功能,，適用于長期的細(xì)胞培養(yǎng)和實驗觀察,。

• 良好的細(xì)胞膜通透性：DiO 能夠快速穿透細(xì)胞膜并插入到脂質(zhì)雙層中，實現(xiàn)對細(xì)胞膜的標(biāo)記,。

• 穩(wěn)定的熒光信號：DiO 嵌入細(xì)胞膜后,，熒光信號穩(wěn)定，不易受到光漂白的影響,，適合長時間的熒光觀察和檢測,。

• 多色熒光標(biāo)記：DiO 發(fā)出綠色熒光，可與其他發(fā)出不同顏色熒光的染料（如 DiI,、DiR）聯(lián)合使用,，實現(xiàn)多色熒光標(biāo)記，為復(fù)雜生物過程的研究提供了更全面的視角,。

注意事項

• 染色濃度優(yōu)化：使用 DiO 時,，需根據(jù)細(xì)胞類型和實驗需求優(yōu)化染色濃度。濃度過高可能導(dǎo)致細(xì)胞膜過度染色或細(xì)胞毒性增加,，而濃度過低則可能使熒光信號不足,。

• 避光操作：DiO 染料對光敏感，操作過程中應(yīng)盡量減少樣本的光照時間,，以防止熒光淬滅,。

• 背景熒光控制：在染色過程中，需確保染色步驟的規(guī)范性,，以減少背景熒光,。例如,，孵育后應(yīng)充分洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的染料,。

• 保存條件：DiO 染料應(yīng)密封保存于干燥,、避光的環(huán)境中，避免接觸強光和高溫,，以保持其活性和穩(wěn)定性,。