高效qinliugan病毒小鼠感染模型的構(gòu)建流程

（一）背景

近日,，全球病毒網(wǎng)絡 (GVN) 是一個由linxian的人類和動物病毒學家組成的國際聯(lián)盟,，其遍布 40 多個國家的 80 多個zhuoyue中心和附屬機構(gòu)已在《柳葉刀區(qū)域衛(wèi)生 - 美洲》上發(fā)表了關(guān)于北美正在發(fā)生的 H5N1 qinliugan疫情的詳細分析和緊急行動呼吁。頂尖科學家發(fā)表了一項行動呼吁,，敦促全球各國政府應對北美日益嚴重的 H5N1 qinliugan疫情,，該疫情已感染動物和人類,，并造成了重大農(nóng)業(yè)損失。

（二）qinliugan病毒（H5N1/H7N9）小鼠感染模型構(gòu)建標準操作流程

主要儀器設備：北京元森凱德生物公司研制生產(chǎn)的動物全身/口鼻動態(tài)氣溶膠暴露系統(tǒng)） + YSKD動物氣管肺遞送定向暴露模塊  

生物安全等級：BSL實驗室（符合WHO《實驗室生物安全手冊》第四版） 

一,、實驗前準備

1. 動物選擇與預處理

6-8周齡SPF級BALB/c或C57BL/6小鼠（優(yōu)先選擇IFNAR1敲除品系以增強病毒易感性）,，獨立通風籠具（IVC）中預適應7天，溫度22±1℃,，濕度50-60%，12小時光照循環(huán),，通過實驗動物福利倫理委員會審批（參考AAALAC國際認證標準） 

2. 病毒株與攻毒液配制

病毒株H5N1或H7N9,，TCID??測定為1×10?~1×10?/mL，病毒原液以PBS（含0.3% BSA,、100 U/mL青霉素/鏈霉素）稀釋至目標濃度,，分裝后-80℃保存，使用前經(jīng)三次凍融循環(huán)確保病毒顆粒分散 

二,、 病毒接種及感染模型構(gòu)建步驟

2.1病毒稀釋：將H5N1qinliugan病毒株用病毒培養(yǎng)基稀釋成不同濃度,，低劑量感染組為1×10^4 PFU/mL，高劑量感染組為1×10^6 PFU/mL,。

2.2 動物全身動態(tài)吸入/口鼻暴露染毒(北京元森凱德生物技術(shù)公司研制生產(chǎn))

粒徑控制：1-3 μm（模擬呼吸道飛沫核心粒徑） 

暴露時間：全身暴露模式：30分鐘（總病毒載量1×10?~1×10? PFU/只）,，口鼻暴露模式：15分鐘（靶向劑量1×103~1×10? PFU/只）

2.3動物氣管肺遞送精準定向暴露

小鼠麻醉：將小鼠放入麻醉誘導箱，使用3%異氟醚誘導麻醉,，待小鼠倒立無掙扎后,，轉(zhuǎn)入維持濃度為1.5% - 2%的麻醉狀態(tài)。

氣管內(nèi)定量霧化接種：

將麻醉后的小鼠固定在BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD生物安全型小動物固定操作臺上,，頭部向上,，頸部稍后仰。使用北京元森凱德生物技術(shù)有限公司研制生產(chǎn)的微量氣管內(nèi)液體霧化器【可精準定量】吸取適量的病毒稀釋液（低劑量組50μL/只,，高劑量組100μL/只）,，經(jīng)BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD小動物可視化插管喉鏡（內(nèi)置微型CMOS攝像頭，支持實時圖像傳輸至外接顯示屏）,，緩慢插入到小鼠的氣管處,，使病毒液霧化噴霧流入氣管。對照組滴加等體積的病毒培養(yǎng)基,。

2.4 感染后處理

小鼠轉(zhuǎn)移至生物安全隔離籠具,，恢復自主呼吸，實時監(jiān)測生命體征（呼吸頻率,、活動度）,，記錄感染后0小時基線數(shù)據(jù)。 

三,、感染進程監(jiān)測

3.1. 臨床觀察與樣本采集

感染后第1,、3、5、7天,，監(jiān)測指標/臨床癥狀：體重下降率（>20%為人道終點）,、豎毛、呼吸困難評分（0-4級） 

樣本采集： 

    - 鼻咽拭子（病毒脫落量檢測） 

    - 肺泡灌洗液（BALF,，qRT-PCR檢測病毒載量） 

    - 肺組織病理切片（HE染色評估間質(zhì)性肺炎程度） 

3.2. 病毒動力學分析

qRT-PCR引物設計：靶向HA基因保守區(qū)（如H5N1 HA-F:5'-CAGCAATGCAGRACAGAT-3'）,，病毒滴度測定：MDCK細胞培養(yǎng)法（TCID??/mL） 

3.3. 免疫應答檢測

血清抗體：感染后第14天采集血清，ELISA檢測H5N1特異性IgG（OD450≥0.5為陽性）,，細胞免疫：流式細胞術(shù)分析肺組織CD8? T細胞比例（CD44?CD62L?效應表型） 

四,、模型驗證標準

4.1 感染成功率：感染后72小時肺組織病毒載量≥1×10? TCID??/g 

4.2 病理特征：典型肺泡上皮細胞壞死+淋巴細胞浸潤（病理評分≥3分） 

4.3一致性驗證：同一批次實驗組內(nèi)個體差異≤15%（CV值） 

五．注意事項

5.1. 實驗人員需全程佩戴正壓防護服（PAPR）及雙重手套 

5.2. 病毒滅活：所有接觸材料需經(jīng)121℃高壓滅菌30分鐘 

5.3. 動物倫理：體重下降超過25%或出現(xiàn)嚴重呼吸困難時立即實施安樂處死(北京元森凱德（YSKD）提供自動型實驗動物安樂窒息系統(tǒng)) 

本方案結(jié)合北京元森凱德生物技術(shù)有限公司,簡稱元森凱德（YSKD）研制生產(chǎn)的高精度氣溶膠全身/口鼻動態(tài)氣溶膠暴露系統(tǒng)） +動物氣管肺遞送定向暴露模塊與閉環(huán)生物安全設計，確保實驗可重復性,?？蓾M足qinliugan病毒跨宿主傳播機制研究、疫苗效力評價等前沿科研需求,。

附：北京元森凱德生物技術(shù)有限公司研制生產(chǎn)的動物霧化吸入給藥儀器,，主要包括大/小動物肺部氣管直接遞送裝置（動物氣道霧化針）、動物口鼻吸入,、僅鼻腔給藥,、全身式暴露染毒、動物煙氣/PM2.5染毒系統(tǒng),、粉塵氣溶膠發(fā)生器,、臭氧動物暴露裝置、動物高低壓氧艙,，此外給客戶多樣化提供自動型實驗動物anlesi系統(tǒng)（窒息系統(tǒng),、二氧化碳安樂處死箱），實驗動物除臭暫存系統(tǒng),，巴馬香豬皮,，NGI Gentle Rocker智能洗盤裝置，NGI新一代撞擊器和ACI安德森撞擊器的校驗與檢測,。

附：北京元森凱德生物技術(shù)有限公司（BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD）,，簡稱元森凱德（YSKD），2013年成立于北京中關(guān)村科技園,，是一家專業(yè)從事生命科學類實驗儀器研制,、生產(chǎn)與銷售的科技創(chuàng)新型企業(yè)。服務毒理學,、藥理學,、免疫學、生物安全,、大氣污染物,、化學物質(zhì)毒性鑒定,、臨床前藥物開發(fā)與安全性評價、呼吸系統(tǒng),、環(huán)境與健康等領(lǐng)域,。

部分用戶案例：哈佛大學，麻省理工學院,，新加坡國立大學,，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學院，中國科學院上海藥物研究所,，中國中醫(yī)科學院中藥研究所,，麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司，康龍化成（寧波）生物醫(yī)藥有限公司,，中日醫(yī)院呼吸病學研究中心/中日友好臨床醫(yī)學研究所,，北京中醫(yī)藥大學,，中國藥科大學,，沈陽藥科大學，復旦大學,，浙江大學,，四川大學，中南大學湘雅醫(yī)學院等