產(chǎn)品特點：蛙病毒(Ranavirus)可以在較廣泛的培養(yǎng)細(xì)胞上生長,，并對感染細(xì)胞具有抑制其大分子生物合成的作用。蛙病毒在細(xì)胞漿中的增殖與痘病毒相似,，但該病毒的核酸合成既依賴于宿主細(xì)胞漿,，又依賴于宿主的細(xì)胞核，該病毒可以感染大多數(shù)昆蟲,，并對幼蟲產(chǎn)生影響,，因此蛙病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用,，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的蛙病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測蛙病毒試劑盒,，它具有下列特點：

1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高,。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)蛙病毒高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng),。

5. 既可用于定性檢測,，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級,。

6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng),。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研。

產(chǎn)品成份

運輸及保存方法：低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限為12個月。

自備試劑：樣品DNA

使用方法

一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照,。

1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6,，5,，4，3,，2,，1。

2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液,，最好用帶芯槍頭,，下同。

3. 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

二,、樣品DNA的制備

7. 如果有N個樣品待提取，最好設(shè)置N+2個提取,，多出的是PC（樣品制備陽性對照）和NC（樣品制備陰性對照）,。可以取陽性對照的1000倍稀釋液10μL再加上一定量的水,，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致,，以此作為PC。另外用水作為NC,。

8. 用自選方法純化樣品的DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容。

三,、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析,，并且只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+4個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板）,，1個用于PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

四,、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品核酸濃度的log值，再推算出其濃度,。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于36,。對待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于36則為陽性,。如果在36-40之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽性。