血液樣本細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)為何難?多重干擾和解決方法一次說(shuō)清,!
在生物醫(yī)學(xué)和制藥領(lǐng)域,,準(zhǔn)確檢測(cè)血液樣本中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量對(duì)于疾病診斷、藥物安全性評(píng)估等工作是非常重要的,。然而,,在利用鱟試劑(LAL)對(duì)血液樣本,包括全血、血清,、血漿及其成分進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí),,往往面臨諸多挑戰(zhàn),堪稱最難處理的樣本類型之一,。
一,、血液樣本檢測(cè)干擾因素剖析
血液是一種極其復(fù)雜的生物組織,存在多種物質(zhì),,會(huì)對(duì)鱟試劑檢測(cè)造成干擾,。
(一)蛋白質(zhì)的中和作用
部分血液蛋白質(zhì)能夠中和細(xì)菌內(nèi)毒素,當(dāng)采用鱟試劑對(duì)血液樣本進(jìn)行定量測(cè)定內(nèi)毒素濃度時(shí),,這些蛋白質(zhì)會(huì)與細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)合,,給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)誤差。
(二)絲氨酸蛋白酶的干擾
血液中含有的絲氨酸蛋白酶,,也會(huì)干擾鱟試劑檢測(cè)過(guò)程,。這些蛋白酶呈現(xiàn)出兩種不同的干擾形式:其中一些蛋白酶會(huì)降解鱟試劑酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的蛋白質(zhì),導(dǎo)致出現(xiàn)抑制反應(yīng),;另一些則會(huì)激活該級(jí)聯(lián)反應(yīng),,導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
(三)(1,3)-β-D-葡聚糖的影響
正常血液中除蛋白質(zhì)外,,還含有少量(1,3)-β-D-葡聚糖,。這種物質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的成分,會(huì)激活LAL酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),。真菌感染會(huì)導(dǎo)致(1,3)-β-D-葡聚糖水平升高,,即便其含量較低,若使用對(duì)(1,3)-β-D-葡聚糖敏感的LAL試劑檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素,,也極易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,。
(四)樣本的復(fù)雜性與個(gè)體差異
此外,血液化學(xué)成分復(fù)雜多變,,受患者或捐獻(xiàn)者生理狀態(tài)的顯著影響,。而生理狀態(tài)又受制于年齡、飲食,、基因構(gòu)成,、健康狀況、疲勞程度,、生活方式等諸多因素,。因此,即便某種處理方案對(duì)多數(shù)樣本有效,,仍可能存在部分樣本無(wú)法有效克服干擾的情況,。
二、樣本處理的策略選擇
雖然通常需要對(duì)樣品進(jìn)行一定處理,但在實(shí)施任何滅活操作前,,建議先對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),。不同樣品的干擾程度因樣本而異,且與檢測(cè)時(shí)的稀釋度相關(guān),,有時(shí)甚至無(wú)需處理,。與許多干擾LAL測(cè)試的樣品類似,對(duì)血液或血清樣本而言,,稀釋樣本直至干擾消除,,往往是較為有效的檢測(cè)方法。當(dāng)然,,通過(guò)處理樣品來(lái)中和干擾因素也具有可行性,,有多種處理手段能夠使引起干擾的蛋白質(zhì)變性或失去活性。
(一)熱滅活法
熱滅活法是首先值得嘗試的處理方式,,該方法不僅效-果-顯-著,,操作也相對(duì)簡(jiǎn)便。不過(guò),,在某些情況下,熱滅活可能會(huì)影響細(xì)菌內(nèi)毒素的表觀濃度,,因?yàn)榧訜釙?huì)增強(qiáng)某些蛋白質(zhì)與細(xì)菌內(nèi)毒素的結(jié)合程度,。為驗(yàn)證熱滅活法的有效性,可以分別檢測(cè)經(jīng)過(guò)熱滅活處理和未處理的樣本,,并對(duì)比兩者結(jié)果,。
(二)化學(xué)處理法
除熱滅活法外,還有一些化學(xué)處理手段,,如添加酸或氯仿等,,但這些方法僅在熱滅活無(wú)效時(shí)推薦使用。實(shí)踐表明,,硝酸,、洗滌劑、氫氧化鈉等處理方式,,能夠有效降低各類全血樣本中的干擾,。無(wú)論采用何種處理方法,每個(gè)檢測(cè)樣本都必須設(shè)置陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照,,這一點(diǎn)至關(guān)重要,。
三、試劑優(yōu)化與檢測(cè)方法的匹配
在血液或血清樣本的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)中,,需注重試劑與檢測(cè)方法的協(xié)同優(yōu)化以確保結(jié)果可靠性,。
(一)試劑優(yōu)化應(yīng)對(duì)葡聚糖干擾
針對(duì)樣本中(1,3)-β-D-葡聚糖對(duì)檢測(cè)的干擾問(wèn)題,科德角國(guó)際合作企業(yè)美國(guó)ACC(Associates Of Cape Cod)公司推出的Glucashield®葡聚糖抑制緩沖液提供了有效解決方案。該緩沖液可與其全系列LAL試劑(涵蓋Pyrotell®凝膠法鱟試劑,、Pyrotell®-T濁度法鱟試劑,、Pyrochrome®顯色法鱟試劑及Chromo-LAL顯色法鱟試劑)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)適配。
▲Glucashield®葡聚糖抑制緩沖液
Glucashield®葡聚糖抑制緩沖液的作用機(jī)制是通過(guò)特定的化學(xué)物質(zhì)與(1,3)-β-D-葡聚糖結(jié)合,,屏蔽葡聚糖對(duì)酶聯(lián)反應(yīng)的干擾,,顯著提升細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)特異性,避免因葡聚糖引發(fā)的假陽(yáng)性結(jié)果,,使檢測(cè)結(jié)果更真實(shí)地反映細(xì)菌內(nèi)毒素水平,。
(二)檢測(cè)方法的選擇與優(yōu)化
不同檢測(cè)方法的適用性需根據(jù)樣本特性進(jìn)行選擇。
1,、凝膠法:憑借高穩(wěn)定性和抗干擾能力,,成為復(fù)雜生物樣本檢測(cè)的首-選方案,它通過(guò)觀察鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)形成凝膠的情況來(lái)判斷細(xì)菌內(nèi)毒素的存在與否及大致含量,。在血液樣本檢測(cè)中,,即使樣本存在一定程度的干擾物質(zhì),凝膠法也能相對(duì)穩(wěn)定地呈現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果,。
2,、顯色法:雖具備操作便捷性,但需警惕血漿/血清在405nm波長(zhǎng)下的光學(xué)干擾,。對(duì)此,,采用含有重氮基連接的Pyrochrome®顯色法鱟試劑,通過(guò)生成540-550nm吸收波長(zhǎng)的顯色產(chǎn)物,,可有效規(guī)避干擾,。但需要注意的是,該方法屬于終點(diǎn)檢測(cè),,相比動(dòng)力學(xué)方法,,其檢測(cè)范圍較窄。
3,、光度法(含顯色/濁度法):實(shí)施光度法(含顯色/濁度法)檢測(cè)全血樣本時(shí),,為避免血細(xì)胞造成的光學(xué)干擾,通常需要先對(duì)樣本進(jìn)行離心處理,。在實(shí)際操作中,,光度法可能從多個(gè)稀釋度的檢測(cè)結(jié)果中得出有效數(shù)據(jù),即陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照“加標(biāo)”回收率在規(guī)定范圍內(nèi),,且樣品檢測(cè)結(jié)果處于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),。
然而,經(jīng)常出現(xiàn)這樣的情況:盡管不同稀釋度下的加標(biāo)回收率一致,,但經(jīng)稀釋校正后的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度,,會(huì)隨著未加標(biāo)樣品稀釋程度的變化而改變,,且濃度往往隨稀釋而升高。這表明,,即便加標(biāo)回收率顯示無(wú)干擾,,但樣品中實(shí)際測(cè)得的細(xì)菌內(nèi)毒素情況說(shuō)明干擾依然存在,添加的加標(biāo)細(xì)菌內(nèi)毒素與樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素表現(xiàn)存在差異,。此時(shí),,可通過(guò)逐級(jí)稀釋直至加標(biāo)/未加標(biāo)樣本濃度趨于一致;若稀釋無(wú)效,,則必須探索其他處理方法來(lái)克服干擾,。在沒有其他有效處理手段的情況下,合理的做法是將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為“大于或等于檢測(cè)到的最高細(xì)菌內(nèi)毒素濃度”,。
四,、綜合策略與技術(shù)支持
血液及血液衍生樣本在鱟試劑(LAL)檢測(cè)中常因干擾因素面臨挑戰(zhàn),需通過(guò)系統(tǒng)的方法開發(fā)確定適宜檢測(cè)技術(shù),。盡管存在多種抗干擾策略,,但優(yōu)先選用簡(jiǎn)單且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法更為高效,其推薦順序依次為稀釋法,、熱失活法和化學(xué)處理法,。此過(guò)程中,專業(yè)技術(shù)支持對(duì)檢測(cè)方案的成功至關(guān)重要,,需結(jié)合樣本特性深度分析及方法學(xué)驗(yàn)證,,以確保結(jié)果可靠性。
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