外泌體作為活細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的膜性囊泡,，攜帶蛋白質(zhì),、核酸和脂類等多種生物活性分子,，在細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞，在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生,、發(fā)展過程中具有重要作用,。因此，外泌體在疾病的早期診斷和治療上具有重要研究價(jià)值,。

近年來,，神經(jīng)退行性疾病（neurodegenerative disease,，ND）的發(fā)病率和死亡率呈不斷升高的趨勢,，它是一類起病隱匿的進(jìn)展性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,，早期確診困難,，因此尋找有效的生物標(biāo)志物在ND患者的早期診斷、臨床治療和預(yù)后監(jiān)測的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,。隨著對ND研究的不斷深入,，發(fā)現(xiàn)大腦中所有細(xì)胞（包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）分泌的外泌體,，都在細(xì)胞通信中發(fā)揮關(guān)鍵作用,，一方面，外泌體不僅在細(xì)胞內(nèi)短距離傳播信號,，而且通過血腦屏障廣泛傳播到整個大腦,。另一方面，外泌體進(jìn)行細(xì)胞間通訊時可以攜帶神經(jīng)退行性疾病中病理性錯誤折疊蛋白,，從而加快疾病的進(jìn)展,。

現(xiàn)對外泌體的一般特性、外泌體與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病相互關(guān)系及其對于神經(jīng)退行性疾病診斷和治療的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行概述,。

圖1       神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病

一、外泌體概述

1983年,，Pan和Johnstone團(tuán)隊(duì)最早在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中,，發(fā)現(xiàn)了一種與轉(zhuǎn)鐵蛋白釋放到細(xì)胞外途徑相關(guān)的小囊泡,，并于1989年定義為外泌體（exosome）。最初,，外泌體被認(rèn)為是一種清除細(xì)胞代謝廢物的運(yùn)輸工具,，越來越多的研究表明，外泌體在細(xì)胞通訊過程中起重要作用,，能夠反映并影響細(xì)胞的生理,、病理狀態(tài)，其中某些分子成份與疾病的發(fā)生,、發(fā)展,、治療有密切聯(lián)系,。

圖2     外泌體

細(xì)胞外囊泡根據(jù)其直徑大小可分為三種，分別為凋亡小體(50～5000 nm),、微泡(100～1000 nm),、外泌體(30～150 nm)。外泌體與細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的小囊泡不同,，外泌體只能由活細(xì)胞分泌,，且能被體內(nèi)多種類型細(xì)胞分泌，廣泛存在于各種體液,。外泌體通過胞吞-胞吐方式由親本細(xì)胞釋放,；首先，胞膜內(nèi)化形成胞內(nèi)體,，胞內(nèi)體聚集形成多泡體(Mullivesicular Bodies, MVBs),，MVBs與親本細(xì)胞膜融合，通過胞吐作用將外泌體排出細(xì)胞,。

圖3     外泌體的釋放與通訊

在釋放到細(xì)胞外環(huán)境后，外泌體通過近分泌,、旁分泌和內(nèi)分泌等三種方式進(jìn)行生物信息的交換和傳遞,，在被受體細(xì)胞攝取后，其內(nèi)載的DNA,、mRNA,、miRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等組分通過改變轉(zhuǎn)錄和翻譯程序影響蛋白質(zhì)的修飾和定位,，調(diào)節(jié)信號級聯(lián)通路,、關(guān)鍵酶反應(yīng)等影響受體細(xì)胞的表型和功能。

外泌體與靶細(xì)胞交流通過以下方式：（1）外泌體膜與受體細(xì)胞膜相互融合,，釋放所攜帶物質(zhì)進(jìn)入受體細(xì)胞,。（2）通過配體受體之間相互作用激活信號通路,。（3）細(xì)胞通過胞吞作用將整個外泌體內(nèi)化后，與溶酶體融合,，將所攜帶物質(zhì)釋放入受體細(xì)胞,。此外，內(nèi)化后的外泌體還可以與MVBs融合,，再次被分泌出細(xì)胞外,。

外泌體由構(gòu)成性分子和運(yùn)載分子共同組成，構(gòu)成性分子取決于釋放外泌體的親本細(xì)胞種類,，其外側(cè)雙層膜結(jié)構(gòu)主要成分為脂質(zhì)和蛋白質(zhì),。外泌體的構(gòu)成及運(yùn)載分子包括RNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì),，其中蛋白質(zhì)包括四次跨膜蛋白(CD9,、CD63、CD81,、CD82 ),、Flotillin、Alix,、TSG101和熱休克蛋白(Hsc70,、Hsp90)等，四次跨膜蛋白常被作為外泌體鑒定標(biāo)志物,。Flotillin主要用于膜蛋白之間的相互交流與信號轉(zhuǎn)導(dǎo),，研究表明FlotiUin可作為阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD )診斷的新型標(biāo)志物。外泌體還攜帶有mRNA,、miRNA,、IncRNA、circRNA,，并轉(zhuǎn)移至其它細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用,，成熟miRNA的一條單鏈可與某些蛋白質(zhì)相互作用，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)。不同外泌體的運(yùn)載分子不盡相同，這與外泌體親本細(xì)胞和外泌體形成過程中各種生理和病理?xiàng)l件有關(guān),。

圖4     外泌體的組成

AD的病理特征為β-淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)沉積形成神經(jīng)炎性斑,，及過度磷酸化Tau蛋白在神經(jīng)元內(nèi)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。AD患者的病理斑塊中有大量的Aβ及外泌體特定標(biāo)志蛋白Alix存在,，Rajendran等發(fā)現(xiàn)Aβ可通過外泌體分泌至細(xì)胞外,，并證實(shí)了外泌體具有在細(xì)胞間傳播毒性Aβ和高磷酸化Tau蛋白的能力,，當(dāng)外泌體途徑被阻斷可減弱Aβ聚集和傳播。有研究報(bào)告：小膠質(zhì)細(xì)胞減少可以抑制Tau蛋白增殖,，小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體合成受到抑制,，可降低Tau蛋白的繁殖與傳播，這說明小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體在AD的發(fā)生發(fā)展中同樣具有重要研究價(jià)值,。另有研究發(fā)現(xiàn)：輕度至重度的AD患者,，腦脊液外泌體中磷酸化Tau蛋白濃度顯著高于早期階段，這表明外泌體相關(guān)的磷酸化Tau蛋白與疾病的進(jìn)展有關(guān),。

圖5      外泌體與阿爾茨海默病

帕金森?。≒arkinson′s disease,，PD），也常被稱為“震顫麻痹”,，是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,。這個疾病的主要原因是由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退化和死亡,，可能與遺傳,、環(huán)境因素及神經(jīng)系統(tǒng)老化等多種因素有關(guān)。PD 是僅次于 AD 的第二大類神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,，65歲以上人群發(fā)病率為2% ,。其病理特征是α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-syn)構(gòu)成的路易小體(Lewy Body，LB)在神經(jīng)元胞體和軸突內(nèi)沉積,。目前認(rèn)為神經(jīng)元功能受損甚至死亡是由α-syn寡聚體引起的,。

α-syn是大腦中大量存在的一種可溶性蛋白質(zhì)，尚不明確其健康狀態(tài)下的功能,，但錯誤折疊和纖維狀聚集的α-syn沉積在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中將導(dǎo)致一系列α-突觸核蛋白病發(fā)生,。

α-syn可被分裝入外泌體釋放到細(xì)胞外環(huán)境，導(dǎo)致類似于朊病毒樣的病理傳播,。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),，PD患者血清外泌體中α-syn含量多于正常對照組，且α-syn以寡聚體形式存在于血清外泌體中,；但PD患者腦脊液總α-syn含量低于正常對照組,，可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于某種保護(hù)機(jī)制向血液系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)α-syn增加，其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究,。將PD患者血清外泌體接種細(xì)胞,，可致其表達(dá)α-syn單體及寡聚體增加；且用PD患者腦脊液外泌體接種健康小鼠,，會使小鼠腦脊液中α-syn的表達(dá)水平呈劑量依賴型增加,，故PD患者血清和腦脊液外泌體可以促進(jìn)靶細(xì)胞中α-syn形成,。依賴于完整的外泌體傳播途徑，與游離α-syn相比,，外泌體中α-syn更容易被受體細(xì)胞內(nèi)化,，在神經(jīng)系統(tǒng)傳播中，毒性更大,。

外泌體形成和分泌過程受自噬—溶酶體途徑(ALP)調(diào)節(jié),。ALP異常時，蛋白質(zhì)清除能力下降,，并影響PD及DLB的發(fā)生發(fā)展,；ALP受損將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)α-syn寡聚體的清除效率降低，引起α-syn寡聚體向細(xì)胞外釋放增加,，導(dǎo)致外泌體中α-syn寡聚體在細(xì)胞間傳播,，加速疾病進(jìn)展。

小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是傳播α-syn寡聚體導(dǎo)致PD進(jìn)展的潛在載體,。用α-syn處理BV-2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞,，發(fā)現(xiàn)α-syn可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌外泌體增加，將此外泌體與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)可致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增多,，說明外泌體在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)PD的進(jìn)展過程中扮演重要角色,。

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,，MS)是一種病因未明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性自身免疫性脫髓鞘疾病，主要累及腦,、脊髓和視神經(jīng),。其主要病理改變包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘、炎性浸潤和軸突破壞等,。

      外泌體在多發(fā)性硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用,。其在體內(nèi)外均可促進(jìn)免疫炎癥因子的趨化和聚集。多發(fā)性硬化的texiaoyao物可降低腦脊液中外泌體的數(shù)量,，提示外泌體可以作為多發(fā)性硬化的標(biāo)志物之一,。炎癥狀態(tài)下，外泌體的表達(dá)增加,，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi),、外炎癥介質(zhì)（IL-1β、IL-6,、COX2,、iNOS等）的交換，炎癥因子的釋放，也促進(jìn)免疫細(xì)胞的趨化,，免疫細(xì)胞反過來增加含炎癥因子的外泌體的釋放,，從正反兩相促進(jìn)疾病進(jìn)程。

研究提示外泌體在MS的病理生理和發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用,。在MS患者的血清和腦脊液中外泌體含量明顯升高,，外周炎性細(xì)胞通過釋放含有γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α),、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎性細(xì)胞因子的外泌體,，進(jìn)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，破壞血腦屏障,，介導(dǎo)MS發(fā)病,。內(nèi)皮細(xì)胞功能受損,、血腦屏障通透性升高,，進(jìn)而使外周激活的淋巴細(xì)胞更易經(jīng)損傷的BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，繼發(fā)脫髓鞘,、軸突破壞等一系列典型病理損傷,。另一方面，這些囊泡中表達(dá)的炎性細(xì)胞因子打破Th17和TregT細(xì)胞之間的平衡,，促進(jìn)疾病進(jìn)展,。

MS至今尚無高度特異的生物學(xué)標(biāo)記物。近年的研究表明,，MS患者的血清和腦脊液中所含外泌體可以作為一種診斷標(biāo)志物,。Welton等指出在MS患者的血清中提取的外泌體中含有50多種蛋白質(zhì)，且有30種已被報(bào)道與MS的疾病進(jìn)展有關(guān),。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，外泌體不僅可早期診斷MS,，更可以區(qū)別MS亞型,。在不同亞型的MS患者分離的外泌體含有不同的miRNA，揭示了外泌體的檢測可以作為一個更簡便更有效的診斷手段,。

      肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種進(jìn)展迅速的神經(jīng)退行性疾病,，以運(yùn)動神經(jīng)元丟失,、隨意肌麻痹等為特征,。在ALS患者的細(xì)胞外泌體中發(fā)現(xiàn)了錯誤折疊的蛋白質(zhì)，如mSOD1、FUS,、TDP43和C9orf72擴(kuò)張DPRS等神經(jīng)毒性成分。

視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica,，NMO）是視神經(jīng)與脊髓同時或相繼受累的急性或亞急性脫髓鞘病變。通過對NMO患者的腦脊液分離出的外泌體的蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),，外泌體內(nèi)含的NMO標(biāo)志性蛋白（例如膠質(zhì)細(xì)胞纖維原酸性蛋白GFAP）的表達(dá)有特異性的增加,，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)相一致。與此同時,，MS,、特發(fā)性縱橫肌炎（I-LETM）的特異性標(biāo)志物也有相應(yīng)表達(dá)。提示我們可以將腦脊液外泌體分析作為神經(jīng)系統(tǒng)免疫疾病鑒別診斷的手段之一,。

這些研究和結(jié)果為外泌體診斷和治療神經(jīng)退行性疾病提供了有力的證據(jù),，但還需要深入研究這類疾病的機(jī)制,，并將這一知識轉(zhuǎn)化為臨床中的應(yīng)用,，從而為疾病治療帶來希望。

外泌體存在于各種體液中,，便于獲得，其成分特異,，所攜帶物質(zhì)不僅能反映親本細(xì)胞的生理和病理狀態(tài),，并且外泌體可保護(hù)其攜帶的miRNA、蛋白質(zhì)等穩(wěn)定存在,，不被核酸酶和蛋白酶降解,，因此，可成為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的診斷重要標(biāo)志物,；因其具有穿過血腦屏障的功能,，對其進(jìn)行修飾、裝載,，將成為藥物治療的載體,，可在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療中發(fā)揮重要的作用。

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病起病隱匿,，早期無明顯臨床癥狀,，但生物特性的變化已經(jīng)在外泌體中體現(xiàn)，因此,，外泌體的改變可為疾病早期診斷提供依據(jù),。目前PD的診斷多依賴于臨床癥狀，但當(dāng)紋狀體中70%至80%和黑質(zhì)中50%的多巴胺能神經(jīng)元丟失時才出現(xiàn)運(yùn)動癥狀，因此,，PD早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物有待進(jìn)一步明確,，人們正在嘗試從腦脊液、血液,、尿液中提取外泌體及外泌體攜帶物質(zhì)進(jìn)行PD早期診斷的探索,。

與腦脊液相比，血液和尿液樣本更易獲得,，但外周血中血小板和紅細(xì)胞會產(chǎn)生大量的α-syn,，若制備樣本時發(fā)生溶血則影響血漿外泌體中α-syn檢測結(jié)果。在PD患者尿液外泌體中可檢測到與PD相關(guān)的LRRK2蛋白,，但由于LRRK2在人體內(nèi)表達(dá)多變,，不能得到穩(wěn)定的檢測結(jié)果，因此不能用于PD的早期診斷,。DJ-1是一種由189個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì),，具有抑制α-syn聚集的作用，有研究發(fā)現(xiàn)男性PD患者尿液外泌體中DJ-1與正常人存在明顯差異,，但研究樣本量較小,，能否成為未來診斷標(biāo)志物仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

腦脊液可直接反映腦內(nèi)病理變化,，故使用腦脊液外泌體樣本對疾病診斷更精確,，但不易獲得。對腦脊液外泌體miRNA分析發(fā)現(xiàn)PD患者腦脊液外泌體較正常對照組有16個miRNA表達(dá)上調(diào),，11個miRNA表達(dá)顯著下調(diào),，而miR-153、miR409-3p,、miR-10a-5p顯著過度表達(dá),，這些差異有望成為PD早期診斷標(biāo)志物。

Aβ在腦內(nèi)沉積是一個長期緩慢過程,，對AD臨床前期診斷有助于早期干預(yù)疾病發(fā)生發(fā)展,。研究表明AD患者血漿腦源性外泌體中總Tau蛋白、P-T181-tau,、P-S396-tau和Aβ-142水平均顯著高于正常對照組，在認(rèn)知正常的高?；颊咧锌蓹z測到磷酸化Tau蛋白,、P-S396-tau和P-T181-tau，這些改變可追溯到AD診斷的10年前,。動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn),，從臨床前的高危人群到AD確診，患者血漿外泌體Aβ1-42水平由逐漸升高到顯著增高，因此,，血漿外泌體Aβ1-42具有刻畫AD進(jìn)展的價(jià)值,。

外泌體的標(biāo)志蛋白Flotillin是位于外泌體脂筏上的疏水性蛋白，可通過影響Ca²⁺穩(wěn)態(tài),、線粒體功能參與AD的發(fā)病,。一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)：與非AD人群相比，AD患者腦脊液和血清中Flotillin水平顯著下降,，用正電子發(fā)射斷層攝影(PET)成像技術(shù)分析Aβ沉積,，發(fā)現(xiàn)血清Flotillin水平與Aβ沉積負(fù)相關(guān)，這表明血清Flotillin 水平可用來評估Aβ沉積,，可用于早期診斷,。

外泌體經(jīng)改造后可回輸至自體，減少因藥物載體帶來的免疫反應(yīng),，提高治療的安全性,，且由于其能夠通過血腦屏障，故可用外泌體作為藥物載體對神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進(jìn)行靶向治療,。中國研究團(tuán)隊(duì)通過飽和溶液孵育法,，成功有效的將多巴胺裝載入血漿外泌體中，通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),，裝載入血漿外泌體的多巴胺透過血腦屏障,，被成功傳送至大腦的黑質(zhì)和紋狀體，且多巴胺在腦內(nèi)分布增加了15倍以上,。有研究團(tuán)隊(duì)將過氧化氫酶(強(qiáng)效抗氧化劑)在不改變外泌體結(jié)構(gòu)的情況下裝載入外泌體,，攜帶過氧化氫酶的外泌體透過血腦屏障，富集在神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,，發(fā)揮強(qiáng)大的保護(hù)作用,。上述的研究結(jié)果將為PD、AD及其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療提供新的方法,。

隨著人口老齡化加劇，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病率越來越高,，給患者,、家庭及社會帶來巨大影響，探究其病理,，對其進(jìn)行早期診斷,、早期干預(yù)成為當(dāng)下解決問題的重點(diǎn)。

       近年來學(xué)術(shù)領(lǐng)域?qū)ν饷隗w的結(jié)構(gòu)和功能等的研究有了重大突破,，已有多項(xiàng)研究證實(shí)外泌體在ND病理和治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,，外泌體自身的優(yōu)越性使其成為細(xì)胞間通訊的重要媒介,，在調(diào)節(jié)正常生命活動和疾病的診斷和治療中能發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能。作為當(dāng)前的研究熱點(diǎn),，外泌體受到了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注,。對外泌體進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病有巨大聯(lián)系，雖然目前僅在研究階段,，實(shí)際應(yīng)用還面臨諸多困難,，但其仍不失為一種有前途的方法。

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