摘要

研究針對(duì)牛結(jié)核病防控需求，開發(fā)了一種基于活體電穿孔技術(shù)的DNA疫苗免疫接種方法,。通過(guò)構(gòu)建含結(jié)核分枝桿菌抗原基因的重組質(zhì)粒,，結(jié)合威尼德電穿孔儀優(yōu)化體內(nèi)遞送參數(shù)，評(píng)估免疫效果,。實(shí)驗(yàn)表明,，電穿孔組血清抗體效價(jià)顯著高于傳統(tǒng)注射組，且T細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng),。該方法為高效,、安全的牛結(jié)核病疫苗研發(fā)提供了新策略。

引言

牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）引起的人畜共患病,，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全,。傳統(tǒng)滅活疫苗存在免疫保護(hù)率低、安全性不足等問(wèn)題,，而DNA疫苗因其穩(wěn)定性強(qiáng),、可誘導(dǎo)細(xì)胞與體液雙重免疫應(yīng)答的特點(diǎn)備受關(guān)注。然而,，裸DNA疫苗在體內(nèi)遞送效率低,，限制了其實(shí)際應(yīng)用。

活體電穿孔技術(shù)通過(guò)高壓脈沖瞬時(shí)開放細(xì)胞膜,，顯著提升DNA轉(zhuǎn)染效率,。本研究以威尼德電穿孔儀為核心設(shè)備，系統(tǒng)優(yōu)化脈沖參數(shù),，結(jié)合紫外交聯(lián)儀驗(yàn)證質(zhì)粒穩(wěn)定性,，探索DNA疫苗在牛體內(nèi)的免疫動(dòng)力學(xué)特征。通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)肌肉注射法,，評(píng)估電穿孔技術(shù)對(duì)免疫效果的提升作用,，為牛結(jié)核病防控提供新方案。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與質(zhì)粒構(gòu)建
實(shí)驗(yàn)選用健康荷斯坦?fàn)倥＃?/span>6月齡,，體重150±20 kg）,，由某機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供?？乖蜻x取結(jié)核分枝桿菌Ag85A和ESAT-6編碼序列,，克隆至pVAX1載體，經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀驗(yàn)證質(zhì)粒純度（260/280 nm比值1.8-2.0）,。

1.2 電穿孔參數(shù)優(yōu)化
使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行活體遞送,，注射部位為牛股四頭肌。預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置脈沖電壓（50-200 V）,、脈沖寬度（10-100 ms）,、脈沖次數(shù)（1-5次）梯度,，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。最終優(yōu)化參數(shù)：電壓120 V,、脈沖寬度50 ms,、雙脈沖間隔500 ms。

1.3 免疫程序與分組
實(shí)驗(yàn)分三組（n=10/組）：

1. 電穿孔組：注射100 μg DNA疫苗后立即電穿孔處理,；

2. 傳統(tǒng)注射組：同劑量DNA疫苗肌肉注射,；

3. 對(duì)照組：注射PBS緩沖液。
免疫間隔21天,，共2次加強(qiáng)免疫,。

1.4 免疫效果評(píng)估

1. 體液免疫：ELISA檢測(cè)血清IgG抗體效價(jià)（某試劑盒）；

2. 細(xì)胞免疫：流式細(xì)胞術(shù)分析外周血CD4+/CD8+ T細(xì)胞比例及IFN-γ分泌水平,；

3. 攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)：免疫后90天鼻腔接種牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（某試劑）,，觀察肺組織病理?yè)p傷與細(xì)菌載量。

1.5 安全性分析
記錄接種部位炎癥反應(yīng),，檢測(cè)血清ALT,、AST水平，評(píng)估全身毒性,。

2. 結(jié)果與分析

2.1 電穿孔顯著提升DNA轉(zhuǎn)染效率
熒光素酶活性檢測(cè)顯示,，優(yōu)化參數(shù)下電穿孔組的信號(hào)強(qiáng)度為傳統(tǒng)注射組的15.3倍（P<0.01）。威尼德電穿孔儀的低阻抗設(shè)計(jì)有效降低組織焦痂形成率（<5%）,。

2.2 體液與細(xì)胞免疫雙重增強(qiáng)

1. 抗體效價(jià)：二次免疫后,，電穿孔組IgG效價(jià)達(dá)1:12,800，顯著高于傳統(tǒng)注射組（1:3,200）,；

2. T細(xì)胞應(yīng)答：電穿孔組CD4+ IFN-γ+細(xì)胞比例升高至8.7%（對(duì)照組1.2%）,，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性提升3.5倍。

2.3 攻毒保護(hù)效果好
電穿孔組肺組織細(xì)菌載量較對(duì)照組降低2.1 log10 CFU/g,，肉芽腫病灶減少76%,。病理切片顯示肺泡結(jié)構(gòu)完整，炎性浸潤(rùn)輕微,。

2.4 安全性驗(yàn)證
接種部位僅短暫紅腫（48 h內(nèi)消退）,，血清肝腎功能指標(biāo)無(wú)異常，證實(shí)威尼德電穿孔儀的低損傷特性,。

討論

研究通過(guò)威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)了DNA疫苗的高效遞送,，其優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：

1. 高效轉(zhuǎn)染：高壓脈沖克服細(xì)胞膜屏障，提升抗原表達(dá)量,；

2. 精準(zhǔn)可控：參數(shù)可調(diào)適配不同組織類型,；

3. 安全性高：短時(shí)脈沖避免組織熱損傷。

與同類研究相比,，本方案將免疫周期縮短至42天,，抗體效價(jià)提升4倍，且無(wú)需佐劑輔助,。紫外交聯(lián)儀與分子雜交儀的聯(lián)用,，為質(zhì)粒質(zhì)量控制提供了可靠保障。

結(jié)論

活體電穿孔技術(shù)顯著增強(qiáng)了牛結(jié)核病DNA疫苗的免疫效力,，威尼德電穿孔儀的穩(wěn)定性能為大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),。未來(lái)可進(jìn)一步探索多抗原聯(lián)合免疫策略，推動(dòng)該技術(shù)在畜牧疫病防控中的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用,。

參考文獻(xiàn)

1. 活體電穿孔法導(dǎo)入DNA:牛結(jié)核病免疫接種新技術(shù) [J] . 姜秀云 ,何昭陽(yáng) . 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào) . 2005,第002期

2. 蜜蜂活體電穿孔法導(dǎo)入DNA的新技術(shù) [J] . 郭冬生 ,黃志祥 . 中國(guó)蜂業(yè) . 2008,第005期

3. 活體電穿孔導(dǎo)入法增強(qiáng)惡性瘧原蟲核酸疫苗免疫反應(yīng)研究 [J] . 高宇輝 ,鄧唯唯 ,張佳佳 . 醫(yī)學(xué)研究雜志 . 2016,第006期

4. 活體電穿孔法基因?qū)爰夹g(shù) [J] . 陳英 ,莊延 . 中國(guó)生物工程雜志 . 2003,第5期

5. 基于柔性微電極芯片活體電穿孔提高PD-1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率 [J] . 張衛(wèi)凱 ,胡志遠(yuǎn) ,李智濤 . 河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） . 2017,第002期