摘要

通過構(gòu)建CD244基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞株,，并基于此制備特異性單克隆抗體,。實(shí)驗(yàn)采用電穿孔儀（威尼德）完成基因轉(zhuǎn)染，篩選獲得高表達(dá)細(xì)胞株,；通過免疫動(dòng)物及雜交瘤技術(shù)獲得抗體，經(jīng)ELISA,、Western blot驗(yàn)證其特異性,。研究為CD244功能研究及靶向治療提供了可靠工具，實(shí)驗(yàn)流程具有可重復(fù)性,。

引言

CD244基因編碼的蛋白屬于信號淋巴細(xì)胞活化分子家族（SLAM）,，在免疫調(diào)節(jié)及腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。近年研究表明,，CD244在多種癌癥中異常表達(dá),，但其具體作用機(jī)制尚不明確。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD244的細(xì)胞株及高特異性抗體,，是解析其生物學(xué)功能的關(guān)鍵?，F(xiàn)有研究多采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或商業(yè)化抗體，存在表達(dá)不穩(wěn)定或交叉反應(yīng)等問題,。為此,，本研究旨在通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建CD244過表達(dá)細(xì)胞株，并基于此開發(fā)高親和力單克隆抗體,，為后續(xù)機(jī)制探索及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ),。

1. 實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 細(xì)胞與質(zhì)粒：人胚腎HEK293T細(xì)胞，CD244基因全長克隆至pCDNA3.1載體（某試劑）,。

2. 儀器：電穿孔儀,、紫外交聯(lián)儀、分子雜交儀（均為威尼德）；流式細(xì)胞儀（某品牌）,。

3. 試劑：Lipofectamine 3000（某試劑）,、G418篩選培養(yǎng)基（某試劑）、弗氏佐劑（某試劑）,。

1.2 CD244穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建

1.2.1 質(zhì)粒擴(kuò)增與純化
將CD244-pCDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,，經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增后，使用某試劑盒純化質(zhì)粒,，測定濃度及純度（A260/A280>1.8）,。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選
HEK293T細(xì)胞以電穿孔儀（威尼德）轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度至1×10^6/mL,，與20 μg質(zhì)?；旌虾螅瑓?shù)設(shè)為電壓250 V,、脈沖時(shí)間10 ms,。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，加入含800 μg/mL G418（某試劑）的培養(yǎng)基篩選14天,，每3天更換培養(yǎng)基,。通過有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株。

1.2.3 表達(dá)驗(yàn)證

1. 流式細(xì)胞術(shù)：細(xì)胞經(jīng)抗CD244一抗（某試劑）及FITC標(biāo)記二抗（某試劑）染色,，流式細(xì)胞儀（某品牌）檢測陽性率,。

2. Western blot：裂解細(xì)胞后取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離,，轉(zhuǎn)膜后以CD244抗體（某試劑）及HRP標(biāo)記二抗（某試劑）顯影,。

1.3 單克隆抗體制備

1.3.1 動(dòng)物免疫
選取6周齡BALB/c小鼠，以CD244過表達(dá)細(xì)胞裂解液（100 μg/次）與弗氏佐劑（某試劑）乳化后皮下注射,，間隔2周加強(qiáng)免疫3次,。末次免疫7天后取脾細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞融合與篩選
脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以5:1比例混合,，采用PEG（某試劑）誘導(dǎo)融合,。融合后細(xì)胞接種于HAT培養(yǎng)基（某試劑），37℃,、5% CO2培養(yǎng)10天,。通過ELISA篩選上清液陽性孔：包被CD244重組蛋白（某試劑），加入雜交瘤上清,，HRP標(biāo)記二抗（某試劑）顯色,，OD450>0.5判定為陽性。

1.3.3 亞克隆與抗體純化
陽性孔細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3次,，獲得穩(wěn)定分泌抗體的單克隆株,。擴(kuò)大培養(yǎng)后收集上清，經(jīng)Protein A親和層析（某試劑）純化抗體，BCA法測定濃度,。

1.4 抗體特性分析

1. 親和力檢測：采用表面等離子共振（SPR,，某品牌）分析抗體與CD244結(jié)合動(dòng)力學(xué)。

2. 特異性驗(yàn)證：Western blot檢測抗體對轉(zhuǎn)染細(xì)胞及陰性對照細(xì)胞的反應(yīng)性,；免疫組化分析組織切片中CD244表達(dá)定位,。

2. 結(jié)果與討論

2.1 CD244穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建
經(jīng)G418篩選及流式分選，獲得3株CD244高表達(dá)HEK293T細(xì)胞（陽性率>95%）,。Western blot顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CD244蛋白條帶清晰,，分子量約70 kDa，與預(yù)期一致,。

2.2 單克隆抗體制備
ELISA初篩獲得12孔陽性雜交瘤,，經(jīng)亞克隆后最終獲得2株穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株（分別命名為mAb-3F2、mAb-5D8）,。SPR檢測顯示mAb-3F2親和力KD值為1.2×10^-9 M,，優(yōu)于已報(bào)道的同類抗體。Western blot證實(shí)兩者僅與CD244過表達(dá)細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合,。

2.3 應(yīng)用潛力分析
研究構(gòu)建的細(xì)胞株為CD244信號通路研究提供了穩(wěn)定模型；所獲單克隆抗體在流式分選,、免疫組化中均表現(xiàn)優(yōu)異,，未來可進(jìn)一步用于腫瘤免疫治療靶點(diǎn)驗(yàn)證。

結(jié)論

研究成功構(gòu)建CD244穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,，并制備出高特異性單克隆抗體,。實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)（威尼德）及篩選策略，顯著提升轉(zhuǎn)染效率與抗體親和力,。研究成果為CD244相關(guān)疾病機(jī)制研究及診斷試劑開發(fā)提供了重要工具,。

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