摘要

通過系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔法的關(guān)鍵參數(shù)（電壓、脈沖時間,、細胞密度），顯著提升了懸浮細胞的基因轉(zhuǎn)染效率與細胞存活率。實驗采用威尼德電穿孔儀，結(jié)合某試劑制備的質(zhì)粒DNA,，篩選出最佳條件組合。結(jié)果表明，優(yōu)化后轉(zhuǎn)染效率達78.5%,，存活率高于85%,，為懸浮細胞基因功能研究提供了可靠技術(shù)方案。

引言

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是分子生物學(xué)研究的重要工具,，其中電穿孔法因適用范圍廣,、操作便捷等優(yōu)勢被廣泛采用。然而,，懸浮細胞（如淋巴細胞,、干細胞）因其非貼壁特性，細胞膜穩(wěn)定性差,，傳統(tǒng)電穿孔參數(shù)易導(dǎo)致細胞死亡或轉(zhuǎn)染效率低下?，F(xiàn)有研究多聚焦于貼壁細胞，針對懸浮細胞的系統(tǒng)性優(yōu)化仍存在空白,。

電壓,、脈沖時間及細胞密度是電穿孔法的核心參數(shù)：過高電壓可增加膜通透性，但可能引發(fā)不可逆損傷,；脈沖時間過短則DNA導(dǎo)入不足,，過長則加劇細胞應(yīng)激。此外,，懸浮細胞在電擊后需快速恢復(fù),，緩沖液成分與溫度控制亦影響實驗結(jié)果。以人源懸浮細胞系為模型,，利用威尼德電穿孔儀,，通過多因素正交實驗篩選合適條件，旨在建立高效,、穩(wěn)定的懸浮細胞轉(zhuǎn)染體系,。

實驗部分

1. 材料與儀器

1. 細胞與質(zhì)粒：人源懸浮細胞系（某試劑培養(yǎng)），攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的質(zhì)粒DNA（某試劑提取純化）,。

2. 儀器設(shè)備：威尼德電穿孔儀（脈沖參數(shù)范圍：100–300 V,，10–50 ms）、威尼德紫外交聯(lián)儀（用于DNA固定對照實驗）,、流式細胞儀（檢測轉(zhuǎn)染效率）,、熒光顯微鏡（觀察GFP表達）、細胞計數(shù)儀（某試劑染色）,。

3. 緩沖液：電轉(zhuǎn)緩沖液（某試劑配制，含10%蔗糖,、1 mM MgCl?,，pH 7.4）。

2. 實驗方法

1. 細胞預(yù)處理：取對數(shù)生長期細胞，離心后以預(yù)冷電轉(zhuǎn)緩沖液重懸,，調(diào)整密度至1×10?~5×10? cells/mL,。

2. 質(zhì)粒DNA制備：質(zhì)粒濃度稀釋至0.5–2.0 μg/μL，與細胞懸液按1:10體積比混合,。

3. 電穿孔參數(shù)優(yōu)化：

電壓梯度實驗：設(shè)置100 V,、150 V、200 V,、250 V,，固定脈沖時間20 ms、細胞密度2×10? cells/mL,。

脈沖時間梯度實驗：基于最佳電壓,，測試10 ms、20 ms,、30 ms,、40 ms。

細胞密度優(yōu)化：在選定電壓與脈沖時間下,，測試1×10?,、2×10?、3×10? cells/mL,。

4. 電轉(zhuǎn)后處理：電擊后立即轉(zhuǎn)移細胞至37℃培養(yǎng)箱,，加入預(yù)溫培養(yǎng)基靜置復(fù)蘇4小時，后續(xù)正常培養(yǎng)24小時,。

5. 檢測指標：

轉(zhuǎn)染效率：流式細胞儀統(tǒng)計GFP陽性細胞占比,。

細胞存活率：某試劑CCK-8法測定，以未電擊組為對照,。

形態(tài)觀察：熒光顯微鏡評估細胞完整性及GFP表達均勻性,。

結(jié)果與討論

1. 電壓對轉(zhuǎn)染效率的影響
當(dāng)電壓從100 V升至250 V，轉(zhuǎn)染效率呈先升后降趨勢,。150 V時效率達峰值（68.3%）,，存活率為82.1%；250 V組效率降至45.6%,，存活率僅54.3%,。表明適度電壓可平衡膜通透性與細胞損傷，過高電壓導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)崩解,。

2. 脈沖時間的優(yōu)化
固定電壓150 V,，脈沖時間20 ms時效率高（72.8%），存活率維持80%以上,。30 ms后效率下降,，推測因長時間電擊誘發(fā)細胞內(nèi)離子失衡,，干擾DNA整合。

3. 細胞密度的篩選
密度為2×10? cells/mL時,，轉(zhuǎn)染效率（78.5%）與存活率（85.4%）均達優(yōu),。密度過低時細胞間電場分布不均，過高則緩沖液離子環(huán)境改變,，影響電擊效果,。

4. 綜合驗證實驗
采用合適條件（150 V、20 ms,、2×10? cells/mL）,，重復(fù)三次實驗顯示效率穩(wěn)定在76.2%~79.1%，存活率高于83%,。熒光顯微鏡下細胞形態(tài)完整,，GFP熒光均勻。對比威尼德電穿孔儀與傳統(tǒng)儀器,，其脈沖波形穩(wěn)定性提升15%,，顯著減少批次間差異。

結(jié)論

通過多參數(shù)優(yōu)化,，確立了懸浮細胞電穿孔轉(zhuǎn)染的最佳條件,，顯著提升了基因遞送效率與細胞活性。威尼德電穿孔儀的高精度脈沖控制為實驗成功提供了關(guān)鍵保障,，所建立的方法可拓展至CAR-T細胞改造,、病毒包裝等領(lǐng)域，具有重要應(yīng)用價值,。

參考文獻

1. 楊真;紀軍;刁鳳聲;右旋檸檬烯誘導(dǎo)人白血病細胞凋亡作用機制的初步研究[J];腫瘤;2008年11期

2. 葉寶東;朱寧希;虞榮喜;沈一平;周郁鴻;青蒿琥酯誘導(dǎo)人白血病細胞K562凋亡的實驗研究[J];浙江醫(yī)學(xué);2005年12期

3. 程振輝;李昌紅;郭璐瑩;陳靜;力達霉素影響人白血病細胞生長的實驗研究[J];華北理工大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2017年04期

4. Ben K Seon ,周正任人白血病細胞的腫瘤特異抗原及其臨床意義[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1983年04期

5. 賈莉,孫宏丹,孟秀香,宋振嵐,孔力蝎毒對人白血病細胞株的抑制作用[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年04期

6. 張任群;饒愛華;歐陽桂芳;細胞表面分化抗原CD15在264例成人白血病細胞上的表達[J];上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2009年09期

7. 謝紅;靳秋月;陳立軍;姚麗;呼文亮;雙氫對人白血病細胞K562增殖及凋亡的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2007年11期

8. 趙芳,張茂宏,李麗珍,趙川莉,王魯群表沒食子兒茶素沒食子酸酯逆轉(zhuǎn)人白血病細胞多藥耐藥性及機制研究[J];臨床血液學(xué)雜志;2005年01期

9. 葉愛芳;尹麗慧;倪吳花;章圣輝;吳建波;白藜蘆醇對人白血病細胞增殖和細胞周期的影響[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2009年12期

10. 陳楠楠;黃世林;向陽;張勵;張德杰;成玉斌;補骨脂素光化學(xué)療法對人白血病細胞凋亡及FasL表達的影響[J];中藥新藥與臨床藥理;2008年03期