4 殼聚糖蝦青素納米顆粒對肝纖維化小鼠肝損傷生長的抑制

4.1 實驗設計的科學依據

• 劑量選擇：參考文獻中蝦青素有效劑量（10-60 mg/kg/d）及殼聚糖納米遞送系統(tǒng)的生物利用度優(yōu)化結果。  

• 陽性對照：選用索拉非尼（5 mg/kg/d）驗證殼聚糖蝦青素納米顆粒與傳統(tǒng)化療藥物的效果差異,。  

• 檢測指標關聯(lián)性：  

肝損傷體積/重量：直接評估抗肝損傷效果,。  

凋亡相關蛋白（Bax/Bcl-2）：揭示誘導凋亡的分子機制。  

肝組織病理學：觀察肝損傷壞死及正常組織損傷程度,。

4.2 技術路線

肝纖維化模型建立 → 肝損傷增殖/氧化應激 → 殼聚糖蝦青素納米顆粒干預 → 抑制增殖/誘導凋亡 + 抗氧化抗炎 → 抑制肝損傷生長,、改善肝功能。  

4.3 實驗材料

• 耗材：1 mL無菌注射器,、鈍頭灌胃針（20-22 G,，3-4 cm）、無菌EP管,、離心管,。

• 試劑：殼聚糖蝦青素納米顆粒（粒徑100-200 nm，Zeta電位+30 mV）,、生理鹽水、索拉非尼,。  

• 設備：電子天平（0.1 mg精度）,、微量移液器（10-1000 μL）,、小動物活體成像系統(tǒng)、小鼠固定器,。  

• 動物：C57BL/6J SPF級小鼠（6-8周齡）

• 實驗周期：肝纖維化建模4周,，干預治療6周。

4.4 實驗步驟

4.4.1 實驗動物分組設計

分組原則：

• 對照全面性：涵蓋正常肝組織,、肝纖維化模型,、干預梯度及陽性對照。  

• 邏輯遞進性：從基礎對照到劑量效應,，明確藥物作用機制,。  

具體分組（每組8-10只）：


4.4.2 藥物配制

1. 納米顆粒懸浮液制備步驟：

原料準備：

• 殼聚糖蝦青素納米顆粒凍干粉（無菌分裝,，避光保存于-20℃）。  

• 生理鹽水（0.9% NaCl,，滅菌處理）,。

母液配制：

• 稱取凍干粉，按 10 mg/mL 濃度加入生理鹽水（例：50 mg凍干粉 + 5 mL生理鹽水）,。  

• 渦旋振蕩：2000 rpm,，持續(xù)10分鐘，確保顆粒充分分散,，避免聚集,。  

• 超聲處理（可選）：20 kHz超聲探頭，功率50 W,，冰浴中超聲3分鐘（間歇脈沖,，開2秒/關1秒），進一步分散納米顆粒,。  

2. 工作液稀釋：

根據劑量需求稀釋至目標濃度（如10 mg/kg或50 mg/kg,，此處的目標濃度是指按照正常成年人（60kg）所需劑量換算成小鼠的給藥量），現(xiàn)用現(xiàn)配,，避光保存（4℃≤24 h）,。  

示例：  目標劑量 10 mg/kg（小鼠體重25 g）：  

• 灌胃體積通常為 0.1 mL/10 g（即0.25 mL/25 g）。  

• 所需濃度 = 劑量（10 mg/kg） × 體重（0.025 kg） / 灌胃體積（0.25 mL） = 1 mg/mL,。  

• 取母液（10 mg/mL）與生理鹽水按 1:9 比例稀釋（如1 mL母液 + 9 mL鹽水）,；

• 50 mg/kg（此處的目標濃度是指按照正常成年人（60kg）所需劑量換算成小鼠的給藥量）所需濃度同上。

3. 質量控制：

粒徑＜200 nm,，Zeta電位＞+30 mV,，無菌過濾（0.22 μm）。  

4. 保存：

• 現(xiàn)配現(xiàn)用,，避光4℃保存≤24 h,。  

• 防聚集：充分渦旋/超聲,，避免靜置。

• 穩(wěn)定性：pH 5.5-6.0（可加0.1%醋酸）,。

• 毒性控制：測試空白載體,，濃度＜2%。

4.4.3 灌胃操作關鍵步驟：

1.灌胃前準備：

• 禁食4小時（不禁水）,，減少胃內容物干擾,。  

• 使用鈍頭灌胃針（直徑1.5 mm），灌胃體積以0.1 mL/10 g體重為依據,，每天固定時間持續(xù)灌胃,，陽性藥是根據正常成年人日口服推薦量和小鼠體重進行等量換算。  

2.固定與進針：

• 抓取小鼠頸背部,，頭部后仰30°,，沿口腔右側緩慢插入灌胃針（深度3-3.5 cm）。  
  

• 遇阻力時退出調整角度,，避免刺傷食道（見以下圖示）,。  
  
  

3.推注與觀察：

• 勻速推注（0.05 mL/s）,，觀察小鼠無嗆咳后退出針頭。  

• 記錄灌胃時間,、劑量及不良反應（如腹瀉,、呼吸困難）。  

4.4.4 C57肝纖維化檢測指標

1. 組織病理

• 染色：Masson（膠原藍染）,、天狼星紅（膠原定量）  

• 評分：Ishak或METAVIR系統(tǒng)  

• 標志物：α-SMA（活化的星狀細胞）  

2. 血清指標

• 損傷：ALT,、AST  

• 纖維化：HA（透明質酸）、PCIII（III型前膠原肽）  

3. 分子檢測

• 基因：Col1a1,、TGF-β1（qPCR）  
  

• 蛋白：Collagen I,、α-SMA（Western Blot）  

4. 功能指標

• 羥脯氨酸：定量肝膠原含量（金標準）

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