2 DMN（二甲基亞硝胺）誘導C57小鼠肝纖維化模型建立

2.1 原理  

二甲基亞硝胺（DMN）通過肝臟代謝生成甲基自由基,，直接損傷肝細胞及肝竇內(nèi)皮細胞，激活炎癥反應（TNF-α,、IL-6釋放）和肝星狀細胞（HSC）活化,，促進膠原蛋白（Ⅰ/Ⅲ型）異常沉積，最終形成肝纖維化,。其機制不依賴致癌性基因突變,，而通過氧化應激與ECM代謝失衡驅(qū)動纖維化進程。

2.2 實驗步驟  

2.2.1 動物準備

• 品系選擇：雄性C57BL/6J小鼠（6-8周齡）,，雄性對DMN肝毒性更敏感,。

• 環(huán)境適應：SPF級環(huán)境中適應1周，自由攝食飲水,，維持12小時光/暗周期,。

2.2.2 DMN給藥方案

纖維化誘導方案：

• 劑量：DMN 1mg/ml（溶于生理鹽水，避光保存,，現(xiàn)用現(xiàn)配）,。  

• 注射方式：每日固定時間1次腹腔注射，每周隔天注射共3天,，隨后停藥4天（每周為1個循環(huán)）,。  

• 總周期：4周（共12次注射）。  

關鍵注意：

• 注射時避免漏液（易致腹膜炎癥）,。

• 每周監(jiān)測體重,，存活率需＞80%（劑量過高易致死）。  

2.2.3 實驗周期

• 急性損傷期：注射后1-2周,，肝細胞壞死與炎癥浸潤顯著,。

• 纖維化形成期：注射后3-4周，門靜脈周圍膠原沉積,，橋接纖維間隔形成,。

2.3 模型驗證方法  

2.3.1 生化指標檢測

• 血清肝功能：ALT、AST水平升高2-3倍（ELISA法）,。

• 肝纖維化標志物：羥脯氨酸（Hyp）含量增加＞50%（比色法）,。

2.3.2 病理學分析

1. 大體觀察：肝臟表面粗糙，可見灰白色纖維條索（圖1）,。

2. 組織切片：

• H&E染色：肝細胞壞死,、炎性細胞浸潤及纖維間隔形成,。

• 天狼星紅染色：膠原沉積面積定量（紅色區(qū)域占比≥15%）。

• 免疫組化：α-SMA（活化的HSC標志物）陽性率＞30%。

2.3.3 分子標志物檢測

• Western blot：TGF-β,、CollagenⅠ蛋白表達顯著上調(diào),。

• qPCR：MMP-2/9下調(diào)，TIMP-1上調(diào),，提示ECM降解受阻,。

總結

DMN通過氧化損傷→炎癥→HSC活化→膠原沉積的級聯(lián)反應誘導肝纖維化,，模型穩(wěn)定且重復性高，需結合多維度指標（生化,、病理,、分子）驗證，適用于抗纖維化機制與藥物研究

2.4 關鍵注意事項

2.4.1 劑量控制

DMN劑量>15 mg/kg可能導致急性肝壞死（圖二）,，<5 mg/kg則肝損傷發(fā)生率低,。

2.4.2 品系與性別差異

• C57BL/6J小鼠對DMN敏感性低于其他品系（如B6C3F1）,，需延長誘導周期。  

• 雌性小鼠因雌激素保護作用,，肝纖維化發(fā)生率顯著低于雄性,。  

2.4.3 倫理與動物福利

• 每周監(jiān)測體重、活動度及毛發(fā)狀態(tài),。  

• 肝損傷體積>2000 mm3或體重下降≥20%時,，使其優(yōu)逝。

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