多年來,，ATCC（美國典型培養(yǎng)物保藏中心）提供的微生物標(biāo)準(zhǔn)品已被CLSI（美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所）和USP（美國藥典）等國際權(quán)-威標(biāo)準(zhǔn)廣泛納入制藥及醫(yī)療質(zhì)量控制體系，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)控,、對照實驗及菌種鑒定,。然而，盡管使用規(guī)范已高度成熟,，實驗室在傳代次數(shù)管理,、非參考菌株傳代閾值界定等實操環(huán)節(jié)仍存在顯著挑戰(zhàn)。這一問題在制藥微生物領(lǐng)域?qū)I(yè)論壇（如PMFList）中持續(xù)引發(fā)討論,，凸顯了制定統(tǒng)一操作框架的迫切性,。

一、參考菌株命名差異與來源要求

參考菌株的命名差異加劇了實驗室對微生物標(biāo)準(zhǔn)品管理的困惑,。在CLSI和USP的各類文件中,，這類培養(yǎng)物被分別稱為“對照菌株”“標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物”“參考菌株”“測試菌株”或“質(zhì)量控制菌株”，其中“參考菌株”或“參考培養(yǎng)物”的稱呼較為普遍,。

盡管這些術(shù)語常被混用,，但兩個組織均強調(diào)，參考菌株必須來源于權(quán)-威機構(gòu),，ATCC（美國典型培養(yǎng)物保藏中心）是主要的推薦來源,，這為實驗室選擇參考菌株提供了明確方向,。

二、ATCC參考菌株的傳代培養(yǎng)體系

ATCC的參考菌株通過傳代培養(yǎng)制成“儲備培養(yǎng)物”,，再通過每周或每月的定期傳代培養(yǎng)制成日常使用的“工作培養(yǎng)物”,，工作培養(yǎng)物通常以斜面形式保存。然而,，這種傳代培養(yǎng)方式引發(fā)了人們對其是否源自原始參考菌株的疑問,。

（一）傳代計數(shù)規(guī)則的演變

核心爭議在于如何界定“一次傳代”的計數(shù)規(guī)則。

早期USP36-NF31<51>抗菌測試的原始定義為：“一次傳代指將生物體從已建立的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基的過程,，所有轉(zhuǎn)移操作均計入傳代次數(shù)”,。但未明確"已建立的培養(yǎng)物"的具體內(nèi)涵。

現(xiàn)行USP<1117>《微生物最佳實驗室規(guī)范》對此進(jìn)行了重要修訂,。更新后的定義為：“傳代指微生物從活體培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基并實現(xiàn)增殖的過程,，任何形式的傳代培養(yǎng)均視為一次轉(zhuǎn)種/傳代?！边@一修訂有效解決了原定義的模糊性,，根據(jù)新定義，ATCC冷凍或凍干菌株的解凍或水化操作不計入傳代,，只有將其接種至新鮮培養(yǎng)基并完成生長后才計為首-次傳代,。

因此，將ATCC冷凍或凍干小瓶中的參考菌株復(fù)蘇制備成儲備培養(yǎng)物屬于首-次傳代,，而將儲備培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種為工作培養(yǎng)物則構(gòu)成第二次傳代,，后續(xù)每次轉(zhuǎn)種均累計增加傳代次數(shù)。通過統(tǒng)一術(shù)語和明確定義,，為抗菌效果測試提供了清晰可追溯的傳代計數(shù)標(biāo)準(zhǔn),。  

在微生物實驗室實踐中，除ATCC官-方提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株外,，商業(yè)機構(gòu)常通過“ATCC衍生”方式獲得培養(yǎng)物——即從ATCC參考菌株出發(fā),，經(jīng)過一次或多次傳代培養(yǎng)獲得的菌株。

（二）“ATCC衍生”培養(yǎng)物的管理

在微生物實驗室實踐中,，商業(yè)機構(gòu)常通過"ATCC衍生"方式獲得培養(yǎng)物,，即從ATCC參考菌株經(jīng)一次或多次傳代培養(yǎng)所得。CLSI認(rèn)可符合資質(zhì)的商業(yè)菌株供應(yīng)商,，但要求實驗室必須關(guān)注菌株傳代歷程,，從原始ATCC參考菌株到最終工作培養(yǎng)物，通常會經(jīng)歷1-2次傳代過程,。

三、參考菌株管理的推薦系統(tǒng)與標(biāo)準(zhǔn)

（一）種子批系統(tǒng)的應(yīng)用

USP推薦采用種子批系統(tǒng)管理參考菌株,，該系統(tǒng)與ATCC使用的系統(tǒng)一致,。操作流程為：先將ATCC參考菌株一次性制備多個重復(fù)傳代培養(yǎng)物,，這些源自同一代原種的重復(fù)培養(yǎng)物作為實驗室的初代種子庫存儲；再將初代種子培養(yǎng)物傳代至第二代,，用于制備工作菌株的多批次培養(yǎng)物,，以此規(guī)范實驗室參考菌株的保存流程。（圖1）

（二）傳代次數(shù)控制標(biāo)準(zhǔn)

不同標(biāo)準(zhǔn)對傳代次數(shù)的要求存在顯著差異,。CLSI早期標(biāo)準(zhǔn)對傳代頻次要求模糊,，后續(xù)修訂版提出三級傳代限制，但推算后原始菌株累計傳代可能達(dá)七次,。而USP標(biāo)準(zhǔn)通過<1117>章節(jié)明確規(guī)定,，實驗室工作培養(yǎng)物與ATCC參考菌株的傳代差值不得超過五次，<51>條款強調(diào)“檢測用活體微生物不得超出原始ATCC菌株五代傳代” ,，這一量化標(biāo)準(zhǔn)被制藥行業(yè)廣泛采用,，ATCC官-方也確認(rèn)五代傳代限制是維持菌株遺傳穩(wěn)定性的最佳實踐。

（三）儲存溫度與維護(hù)要求

菌株的儲存溫度對其生物學(xué)特性及存活率具有顯著影響,，各標(biāo)準(zhǔn)機構(gòu)對此給出了詳細(xì)指引,。

1、CLSI標(biāo)準(zhǔn)

（1）原代培養(yǎng)物：

短期保存：-50℃至-70℃保存1年,。

長期保存：-70℃以下,。

延長儲存：-20℃或更低溫度（優(yōu)先推薦-70℃以下）

（2）工作培養(yǎng)物（斜面）：

短期保存：2-8℃環(huán)境，保存周期≤4周,。

2,、USP36-NF31<51>條款

（1）培養(yǎng)物：必須儲存于液氮或-50℃以下的機械冷凍設(shè)備。

3,、ATCC標(biāo)準(zhǔn)

（1）冷凍菌株：

長期保存：液氮氣相環(huán)境或-80℃機械冷凍箱（避免直接浸入液氮）,。

甘油保護(hù)劑：含50%甘油的菌株可短期保存于-20℃（≤1個月），需避免溫度波動（如反復(fù)凍融）,。

（2）凍干菌株：2-8℃保存,。

（3）凍干菌株（斜面）：2-8℃保存≤1周。

4,、特殊注意事項

質(zhì)控菌株（如攜帶耐藥基因質(zhì)粒）：需嚴(yán)格遵循CLSI最新標(biāo)準(zhǔn),。