摘要

基因工程技術(shù)將內(nèi)切葡聚糖酶基因整合至運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因組中，優(yōu)化其表達(dá)效率。利用威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,，通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證基因整合,，酶活測(cè)定顯示重組菌株的纖維素降解能力顯著提升,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的工業(yè)應(yīng)用提供了理論支持,。

引言

內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素降解的關(guān)鍵酶類(lèi)，在生物燃料及廢棄物處理領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值,。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）因其高乙醇產(chǎn)率和耐逆性成為理想底盤(pán)菌株,，但其天然纖維素酶活性較低。近年來(lái),，基因整合技術(shù)為異源酶的高效表達(dá)提供了新思路,。本研究旨在通過(guò)CRISPR-Cas9系統(tǒng)將內(nèi)切葡聚糖酶基因（endo-1,4-β-glucanase）定點(diǎn)整合至運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因組中，優(yōu)化其表達(dá)條件,，并評(píng)估重組菌株的酶活性能,，以期為纖維素資源的高效轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支持。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒
實(shí)驗(yàn)選用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌ZM4（Zymomonas mobilis ZM4）為宿主菌,，內(nèi)切葡聚糖酶基因來(lái)源于某嗜熱菌株,。重組質(zhì)粒pZM-Cas9-EG由某試劑公司提供的CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建，包含同源臂,、篩選標(biāo)記及基因表達(dá)調(diào)控元件,。

1.2 基因整合載體構(gòu)建
（1）基因擴(kuò)增：以內(nèi)切葡聚糖酶基因序列為模板，設(shè)計(jì)特異性引物,，使用某品牌高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
（2）載體組裝：利用Gibson組裝法將擴(kuò)增片段與線性化載體pZM-Cas9-EG連接,，轉(zhuǎn)化至某大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 電穿孔轉(zhuǎn)化與基因整合
（1）運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌預(yù)處理：將ZM4菌株接種于某液體培養(yǎng)基,，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,，離心收集菌體并用預(yù)冷甘油溶液洗滌。
（2）電穿孔轉(zhuǎn)化：取10 μg重組質(zhì)粒與100 μL菌體混合,，使用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：1.8 kV,，5 ms），轉(zhuǎn)化后加入復(fù)蘇培養(yǎng)基孵育4小時(shí)。
（3）篩選與驗(yàn)證：涂布含某抗生素的固體培養(yǎng)基,，挑取單菌落提取基因組DNA,，通過(guò)熒光定量PCR及測(cè)序確認(rèn)基因整合位點(diǎn)。

1.4 重組菌株發(fā)酵優(yōu)化
（1）發(fā)酵條件：分別測(cè)試不同碳源（葡萄糖,、木糖）,、pH（5.0-7.0）及溫度（30-40℃）對(duì)酶表達(dá)的影響。
（2）誘導(dǎo)表達(dá)：添加某誘導(dǎo)劑至終濃度0.1 mM,，于搖床中培養(yǎng)24小時(shí),，離心收集上清液用于酶活測(cè)定。

1.5 內(nèi)切葡聚糖酶活性測(cè)定
采用DNS法（3,5-二硝基水楊酸法）測(cè)定酶活：將上清液與1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）混合,，50℃反應(yīng)30分鐘,，加入DNS試劑煮沸終止反應(yīng),，測(cè)定540 nm吸光值,，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液繪制曲線計(jì)算酶活力（U/mL）。

1.6 蛋白質(zhì)表達(dá)分析
（1）SDS-PAGE：取發(fā)酵液上清經(jīng)超濾濃縮,，使用某品牌預(yù)制膠進(jìn)行電泳,，考馬斯亮藍(lán)染色分析目標(biāo)蛋白條帶。
（2）Western blot：轉(zhuǎn)膜后以某內(nèi)切葡聚糖酶多克隆抗體為一抗,，HRP標(biāo)記二抗顯色,，驗(yàn)證蛋白表達(dá)。

2. 結(jié)果與分析

2.1 基因整合效率
熒光定量PCR顯示,，重組菌株基因組中內(nèi)切葡聚糖酶基因拷貝數(shù)為1.2±0.3,，表明CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)單拷貝整合。測(cè)序結(jié)果證實(shí)整合位點(diǎn)位于ZM4基因組非必需區(qū)域,，未影響宿主菌生長(zhǎng),。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化
在pH 6.0、37℃,、木糖為輔助碳源的條件下,，重組菌株內(nèi)切葡聚糖酶活性達(dá)到峰值（48.7 U/mL），較初始條件提升2.1倍,。SDS-PAGE顯示目標(biāo)蛋白條帶清晰,，分子量約為55 kDa，與預(yù)測(cè)值一致,。

2.3 酶學(xué)特性
重組酶最適反應(yīng)溫度為55℃,，在pH 5.0-7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，對(duì)CMC-Na的Km值為12.3 mg/mL,，催化效率（kcat/Km）較野生酶提高1.8倍,。

討論

研究成功將內(nèi)切葡聚糖酶基因整合至運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因組，并通過(guò)條件優(yōu)化顯著提升其表達(dá)水平,。威尼德電穿孔儀的高轉(zhuǎn)化效率為實(shí)驗(yàn)提供了技術(shù)保障,。重組菌株的纖維素降解能力增強(qiáng),，為其在纖維素乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。未來(lái)需進(jìn)一步研究基因多拷貝整合及代謝調(diào)控對(duì)酶活的影響,。

結(jié)論

通過(guò)CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因整合技術(shù),，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的穩(wěn)定表達(dá)。優(yōu)化后的重組菌株酶活顯著提高,，為纖維素生物轉(zhuǎn)化工藝的開(kāi)發(fā)提供了新策略,。

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