凝膠色譜儀如何解析蛋白純度與聚集體

來(lái)源：上海杜凱生物科技有限公司 2025年04月16日 17:50

　　凝膠色譜儀（GPC/GFC）是蛋白質(zhì)純度分析與聚集體檢測(cè)的核心工具,，其核心原理基于分子篩效應(yīng)：大分子因無(wú)法進(jìn)入凝膠孔隙而快速流出,，小分子則因深入孔隙而延遲洗脫，從而實(shí)現(xiàn)分子量依賴的分離,。以下是具體解析方法：

　　一,、蛋白純度分析

　　分離機(jī)制

　　使用葡聚糖（Sephadex）或瓊脂糖（Sepharose）填料構(gòu)建凝膠柱，流動(dòng)相為低離子強(qiáng)度緩沖液（如PBS）,。

　　目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)（如宿主細(xì)胞蛋白、核酸）因分子量差異被分離,，純蛋白在單一峰中洗脫,，雜質(zhì)形成肩峰或拖尾。

　　純度評(píng)估

　　峰面積積分：通過(guò)紫外檢測(cè)器（UV280nm）計(jì)算目標(biāo)蛋白峰面積占比,，純度=目標(biāo)峰面積/總面積×100%,。

　　標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比：與已知純度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（如BSA）共跑，對(duì)比保留時(shí)間與峰形一致性,。

　　二,、聚集體檢測(cè)

　　聚集體形成機(jī)制

　　蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存、運(yùn)輸或高溫條件下易發(fā)生二硫鍵交換,、疏水相互作用,，形成二聚體、寡聚體甚至可溶性聚集體,。

　　檢測(cè)方法

　　多角度光散射（MALS）聯(lián)用：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子量變化,，聚集體表現(xiàn)為保留時(shí)間提前且分子量顯著增大（如單體50kDavs二聚體100kDa）。

　　峰形分析：聚集體導(dǎo)致峰形不對(duì)稱（前延或拖尾）,，通過(guò)第二維分析（如SEC-MALS）可定量聚集體比例,。

　　案例

　　某單抗藥物在40℃儲(chǔ)存后，凝膠色譜圖顯示主峰前出現(xiàn)肩峰,，MALS檢測(cè)到20%二聚體,，證實(shí)高溫導(dǎo)致聚集。

　　三,、技術(shù)優(yōu)化

　　柱效提升：使用小粒徑填料（如3μm）提高分辨率,，縮短分析時(shí)間至15分鐘。

　　溶劑兼容性：選擇pH耐受范圍廣的凝膠（如Superdex200Increase）,，避免蛋白變性,。

　　自動(dòng)化：結(jié)合液相色譜系統(tǒng)（如AKTA），實(shí)現(xiàn)梯度洗脫與在線濃度監(jiān)測(cè)。

　　凝膠色譜儀通過(guò)分子量依賴的分離機(jī)制,，可直觀解析蛋白純度與聚集體水平,，為生物制藥質(zhì)量控制提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支持。

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