摘要

通過系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔參數(shù)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染比例及外源DNA濃度,，顯著提升了山羊胎兒成纖維細(xì)胞中外源基因的整合效率。實驗表明,，電穿孔條件為電壓150 V、脈沖時長10 ms時,，轉(zhuǎn)染效率達42.5%,；聯(lián)合優(yōu)化脂質(zhì)體比例（1:3）及DNA濃度（4 μg/mL）后,，整合效率提升至58.3%。研究結(jié)果為高效制備轉(zhuǎn)基因山羊體細(xì)胞提供了可靠技術(shù)方案,。

引言

外源基因轉(zhuǎn)染與整合效率是體細(xì)胞克隆與轉(zhuǎn)基因動物制備的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸,。山羊胎兒成纖維細(xì)胞（GFb）作為核移植常用供體細(xì)胞，其基因編輯效率直接影響后續(xù)胚胎發(fā)育成功率,。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法存在整合率低,、細(xì)胞毒性高等問題，亟需建立穩(wěn)定高效的優(yōu)化體系,。

聚焦電穿孔與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染兩大技術(shù),，通過參數(shù)梯度設(shè)計，系統(tǒng)探究電壓,、脈沖時長、脂質(zhì)體/DNA比例及外源DNA濃度對轉(zhuǎn)染效率的影響,，并采用熒光標(biāo)記,、qPCR及Southern blot驗證整合穩(wěn)定性，旨在為轉(zhuǎn)基因山羊研究提供高效,、低損傷的細(xì)胞改造方案,。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 實驗材料

細(xì)胞系：山羊胎兒成纖維細(xì)胞（GFb），取自3月齡流產(chǎn)胎兒,，經(jīng)膠原酶消化法分離培養(yǎng),。

外源基因載體：pEGFP-N1質(zhì)粒（某試劑），攜帶綠色熒光蛋白（GFP）及新霉素抗性基因,。

儀器：威尼德電穿孔儀,、威尼德紫外交聯(lián)儀、威尼德分子雜交儀,。

1.2 實驗設(shè)計
實驗分為三部分：

電穿孔參數(shù)優(yōu)化：設(shè)置電壓梯度（80 V,、120 V、150 V,、180 V）及脈沖時長（5 ms,、10 ms、15 ms）,，每組重復(fù)3次,。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染比例優(yōu)化：脂質(zhì)體（某試劑）與DNA質(zhì)量比設(shè)為1:1、1:2,、1:3,、1:4，檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率及GFP表達量,。

DNA濃度優(yōu)化：外源DNA濃度梯度為2 μg/mL,、4 μg/mL,、6 μg/mL、8 μg/mL,，評估整合效率與細(xì)胞毒性關(guān)系,。

1.3 實驗步驟

細(xì)胞培養(yǎng)與預(yù)處理：GFb細(xì)胞于DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中擴增，轉(zhuǎn)染前24 h調(diào)整密度至5×10^5 cells/mL,。

電穿孔轉(zhuǎn)染：取1 mL細(xì)胞懸液與4 μg質(zhì)?；旌希尤胪岬码姶┛變x專用電擊杯,，按預(yù)設(shè)參數(shù)處理,，后續(xù)培養(yǎng)48 h觀察熒光表達。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：按比例混合脂質(zhì)體與質(zhì)粒,，靜置20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液,，37℃孵育6 h更換培養(yǎng)基。

整合效率檢測：

熒光顯微鏡計數(shù)：統(tǒng)計GFP陽性細(xì)胞比例,；

流式細(xì)胞術(shù)：定量分析轉(zhuǎn)染效率,；

qPCR與Southern blot（威尼德紫外交聯(lián)儀、分子雜交儀）：驗證外源基因整合位點及拷貝數(shù),。

2. 結(jié)果與分析

2.1 電穿孔參數(shù)對轉(zhuǎn)染效率的影響
電壓150 V,、脈沖時長10 ms時，GFb細(xì)胞存活率最高（89.2%）,，轉(zhuǎn)染效率達42.5%,；高于180 V時細(xì)胞損傷顯著（存活率＜60%）。

2.2 脂質(zhì)體/DNA比例優(yōu)化
脂質(zhì)體與DNA質(zhì)量比1:3時,，GFP表達率最高（48.7%）,，且細(xì)胞毒性低（存活率92.1%）。

2.3 DNA濃度與整合效率關(guān)系
外源DNA濃度為4 μg/mL時,，Southern blot檢測顯示單拷貝整合占比68.3%,，高于高濃度組（6-8 μg/mL）的多拷貝隨機整合現(xiàn)象。

2.4 聯(lián)合優(yōu)化效果
綜合合理參數(shù)（電穿孔150 V/10 ms + 脂質(zhì)體1:3 + DNA 4 μg/mL）,，轉(zhuǎn)染效率提升至58.3%,，且外源基因穩(wěn)定整合率提高1.8倍。

討論

電穿孔參數(shù)中適中的電壓與脈沖時長可平衡細(xì)胞膜通透性與存活率,，而脂質(zhì)體比例優(yōu)化能有效提升DNA-載體復(fù)合物穩(wěn)定性,。威尼德電穿孔儀的高精度脈沖控制及紫外交聯(lián)儀的均勻交聯(lián)特性，為實驗數(shù)據(jù)可靠性提供了保障,。此外,，某試劑脂質(zhì)體的低細(xì)胞毒性特性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑。

值得注意的是,，外源DNA濃度過高易導(dǎo)致多拷貝隨機整合,，可能干擾靶基因功能,。因此，4 μg/mL為本實驗推薦閾值,。

結(jié)論

通過系統(tǒng)優(yōu)化電穿孔,、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及DNA濃度參數(shù)，本研究成功將山羊體細(xì)胞外源基因整合效率提升至58.3%,，為轉(zhuǎn)基因山羊制備提供了高效技術(shù)方案,。威尼德系列儀器的穩(wěn)定性能與某試劑的高兼容性是實驗成功的關(guān)鍵支撐。未來將進一步驗證該體系在大型動物基因編輯中的普適性,。

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