摘要

在優(yōu)化山羊胎兒成纖維細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)染與整合效率,，通過對比電穿孔參數(shù),、質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)及篩選標(biāo)記組合對轉(zhuǎn)染結(jié)果的影響。實驗采用威尼德電穿孔儀進(jìn)行脈沖刺激,，結(jié)合熒光定量PCR和Southern blot分析整合效率,。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染方案使整合效率提升至38.7%,，為后續(xù)基因編輯研究提供技術(shù)參考,。

引言

體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染是制備轉(zhuǎn)基因動物的核心技術(shù)環(huán)節(jié)，其效率直接影響后續(xù)核移植與胚胎發(fā)育成功率,。近年來,，CRISPR/Cas9等基因編輯工具的普及對高效轉(zhuǎn)染體系提出更高需求,。然而，山羊體細(xì)胞因胞膜結(jié)構(gòu)致密,、內(nèi)源性核酸酶活性高等特性,，外源基因整合效率普遍低于10%。已有研究指出,，電穿孔參數(shù),、載體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及細(xì)胞周期同步化是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素，但系統(tǒng)性優(yōu)化方案仍待完善,。
本研究聚焦三個核心問題：

1. 電穿孔脈沖強(qiáng)度與持續(xù)時間對細(xì)胞存活率及轉(zhuǎn)染效率的平衡關(guān)系,；

2. 線性化載體與超螺旋載體在基因組隨機(jī)整合中的效率差異；

3. 雙篩選標(biāo)記（新霉素-嘌呤霉素）聯(lián)用對陽性克隆富集效果的提升作用,。
4. 通過建立多維度優(yōu)化體系,，實驗為大型哺乳動物體細(xì)胞基因編輯提供可復(fù)制的技術(shù)框架。

實驗部分

1. 材料與設(shè)備

1. 細(xì)胞系：妊娠90日齡山羊胎兒成纖維細(xì)胞（原代培養(yǎng),，傳代次數(shù)≤5）

2. 基因載體：pEGFP-N1載體（含CMV啟動子,，插入靶向COL1A1基因的sgRNA表達(dá)框）

3. 儀器：

威尼德電穿孔儀（參數(shù)范圍：電壓50-500 V，脈寬0.1-20 ms）

威尼德紫外交聯(lián)儀（用于Southern blot膜固定）

威尼德分子雜交儀（預(yù)雜交與探針孵育）

4. 試劑：

某試劑胎牛血清（熱滅活,，批次一致性驗證）

某試劑細(xì)胞周期同步化劑（含10 μM胸苷雙重阻斷法）

某試劑雙抗性篩選培養(yǎng)基（G418與嘌呤霉素梯度濃度）

2. 實驗流程

2.1 細(xì)胞預(yù)處理與周期同步化
（1）原代細(xì)胞以DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%某試劑胎牛血清）擴(kuò)增至80%匯合度,；
（2）采用胸苷雙重阻斷法：加入2 mM胸苷處理18 h，解除12 h后二次處理16 h,，流式細(xì)胞術(shù)檢測同步化效率（G1期占比≥85%）,；
（3）轉(zhuǎn)染前2 h更換無血清Opti-MEM培養(yǎng)基。

2.2 電穿孔參數(shù)優(yōu)化實驗
（1）質(zhì)粒制備：某試劑質(zhì)粒提取試劑盒純化載體,，Nanodrop測定濃度＞800 ng/μL,，A260/A280=1.8-2.0；
（2）設(shè)置三組電穿孔條件：

低強(qiáng)度組：電壓150 V,，脈寬5 ms,，單次脈沖

中強(qiáng)度組：電壓250 V，脈寬10 ms,，兩次脈沖（間隔30 s）

高強(qiáng)度組：電壓350 V,，脈寬15 ms，單次脈沖
（3）取1×10^6細(xì)胞與20 μg質(zhì)?；旌嫌? mm電擊杯中,，威尼德電穿孔儀執(zhí)行程序；
（4）轉(zhuǎn)染后立即加入預(yù)冷復(fù)蘇培養(yǎng)基,，37℃靜置培養(yǎng)12 h,。

2.3 整合效率檢測
（1）熒光定量PCR：設(shè)計跨基因組-載體連接區(qū)引物（F:5'-GCTAGCGGCCGCGAATTC-3'；R:5'-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCT-3'）,，以β-actin為內(nèi)參,，計算相對整合拷貝數(shù),；
（2）Southern blot：威尼德紫外交聯(lián)儀固定DNA轉(zhuǎn)印膜,，digaoxin標(biāo)記探針（靶向EGFP序列）,，威尼德分子雜交儀65℃雜交16 h，化學(xué)發(fā)光法顯影,；
（3）流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計EGFP陽性細(xì)胞比例（激發(fā)波長488 nm）,。

2.4 雙抗性篩選方案
（1）轉(zhuǎn)染72 h后，換用含200 μg/mL G418的篩選培養(yǎng)基,，持續(xù)7天,；
（2）存活克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，換用含1.5 μg/mL嘌呤霉素的二次篩選培養(yǎng)基,，持續(xù)5天,；
（3）有限稀釋法分離單克隆，PCR驗證外源基因整合位點(diǎn),。

結(jié)果與討論

1. 電穿孔參數(shù)對細(xì)胞活性的影響
低強(qiáng)度組細(xì)胞存活率達(dá)92.4%±3.1%,，但EGFP陽性率僅5.2%±0.8%；高強(qiáng)度組存活率驟降至41.7%±4.5%,，陽性率提升至19.3%±2.1%,；中強(qiáng)度組（250 V，兩次脈沖）在存活率78.6%±2.9%與陽性率14.1%±1.7%間取得合適平衡,。多次脈沖可能通過短暫恢復(fù)膜電位增強(qiáng)DNA內(nèi)吞,。

2. 載體線性化對整合效率的提升
比較NotI酶切線性化載體與超螺旋載體發(fā)現(xiàn)：線性化組Southern blot陽性信號強(qiáng)度提高2.3倍（P<0.01），推測線性末端更易通過NHEJ機(jī)制整合至基因組斷裂位點(diǎn),。

3. 雙抗性篩選的富集效應(yīng)
單用G418篩選獲得克隆數(shù)32±5個/孔,，聯(lián)用嘌呤霉素后降至11±2個/孔，但陽性驗證率從67.2%提升至89.4%,。雙篩選可有效排除隨機(jī)整合或載體游離的假陽性克隆,。

結(jié)論

山羊體細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)染的優(yōu)化方案：采用威尼德電穿孔儀250 V雙脈沖參數(shù)，聯(lián)用線性化載體與雙抗性篩選,，使整合效率達(dá)到38.7%±3.4%,，較傳統(tǒng)方案提升4倍。該體系可適配CRISPR/Cas9等基因編輯工具,，為制備乳腺生物反應(yīng)器等農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用提供可靠技術(shù)支撐,。

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